Tumor supresivni microrna-133a uravnava nove molekularne mreže v pljučnoceličnem karcinomu pljuč | časopis za človeško genetiko

Tumor supresivni microrna-133a uravnava nove molekularne mreže v pljučnoceličnem karcinomu pljuč | časopis za človeško genetiko

Anonim

Izvleček

Analiza izraza mikroRNA (miRNA) pljučnega ploščatoceličnega karcinoma pljuč (pljuč-SCC) je pokazala, da so bile stopnje raka ekspresije miR-133a v nižjih tkivih v primerjavi z običajnimi tkivi znatno zmanjšane. V tej raziskavi smo se osredotočili na funkcionalni pomen miR-133a v rakavih celičnih linijah, ki izhaja iz pljučnega SCC, in identifikacijo miR-133a- reguliranih novih mrež raka v pljučih-SCC. Obnovitev izražanja miR-133a v celičnih linijah PC10 in H157 je povzročila znatno zaviranje proliferacije celic, kar kaže na to, da miR-133a deluje kot zaviralec tumorja. Za določitev molekulskih tarč miR-133a regulacije smo uporabili analizo genske ekspresije na celotnem genomu. Podatki o genski ekspresiji in spletnem iskanju so razkrili več genov-kandidatov, vključno s transgelinom 2 ( TAGLN2 ), z aktinom povezanim kompleksom protein2 / 3, podenoto 5, 16kDa ( ARPC5 ), homologom LAG1, ceramid sintazo 2 ( LASS2 ) in glutation S-transferazom pi 1 ( GSTP1 ). ARPC5 in GSTP1 verjetno predstavljata dobronamerne tarče, saj je v kliničnih vzorcih pljučnega SCC njihova ekspresija povišana. Poleg tega je prehodna transfekcija miR-133a , potisnjena ARPC5 in GSTP1 mRNA in ravni proteinov. Ker je bila celična proliferacija znatno zavirana v celicah pljuč-SCC, potem ko so RNAi podrli kateri koli gen, lahko ARPC5 in GSTP1 delujeta kot onkogeni pri razvoju pljučnega SCC. Identifikacija tumorsko-supresivne miRNA in novih poti raka, ki jih ureja, bi lahko zagotovili nov vpogled v potencialne molekularne mehanizme karcinogeneze pljuč in SCC.

Uvod

Rak pljuč je očitno glavni vzrok smrti, povezane z rakom po vsem svetu. Na Japonskem ima vsako leto približno 60 000 smrti in je glavni vzrok smrti zaradi raka pri moških in tretji vodilni vzrok pri ženskah. Približno 80% pljučnih rakov je histopatološko razvrščenih kot nedrobnocelični pljučni rak (NSCLC). NSCLC je razdeljen na štiri glavne histološke podtipe z izrazitimi patološkimi značilnostmi: adenokarcinom, ploščatocelični karcinom, velikocelični karcinom in nevroendokrini rak. 1, 2 Kurativni rezultati so ugotovljeni le pri bolnikih z zgodnjo stopnjo bolezni, ki so bili operirani, s 5-letno skupno stopnjo preživetja 50–60%, 1, 2, medtem ko bolniki v naprednih fazah kljub agresivni kemoterapiji redko preživijo več kot 5 let, molekularno usmerjena terapija ali kemoradioterapija. 3, 4

Znano je, da ima spremenjena ekspresija receptorjev rastnega faktorja celične površine, vključno z družino receptorskih tirozin kinaz (RTK), pomembno vlogo pri razvoju številnih vrst raka, vključno z NSCLC. 5 Prekomerno izražanje receptorjev za epidermalni rastni faktor (znan tudi kot Erb1) in drugi člani ErbB družine receptorskih tirozinskih kinaz (ErbB2 in ErbB3) je pogosto opaziti pri številnih rakih in prispeva k povečani proliferaciji celic. 6 Na podlagi tega dejstva je bilo pri rakih na pljučih zasnovanih več terapevtskih učinkovin, kot sta gefitinib in erlotinib za mutacijo receptorskega gena epidermalnega rastnega faktorja in crizotinib za fuzijski gen EML4-ALK. 7 Vendar takšna molekularno usmerjena strategija ni bila razvita za ploščatocelični karcinom, temveč le za adenokarcinom pljuč. Nova analiza RNA na celotnem genomu pljučnoceličnega karcinoma pljuč (pljuč-SCC) lahko ponudi nove možnosti za raziskave in razvoj novih diagnostičnih pristopov in terapij za pljučni SCC.

V zadnjih nekaj desetletjih so bili prepoznani in vpleteni v pljučni rak številni geni (npr. RAS , MYC , PTEN in EGFR ), ki imajo tudi vlogo pri normalni rasti in diferenciaciji celic. Nedavne študije so pokazale, da normalni regulativni mehanizmi pri teh rakavih poteh motijo ​​abrarantno izražanje mikroRNA (miRNA). 8 MiRNA so razred majhnih nekodiranih molekul RNA, sestavljenih iz 19–22 nukleotidov, ki uravnavajo ekspresijo genov s translacijsko represijo in cepitvijo mRNA, 8 in imajo pomembno vlogo v različnih bioloških procesih, vključno z razvojem, diferenciacijo, apoptozo in celicami širjenje. Bioinformatske napovedi kažejo, da miRNA uravnavajo več kot 30% genov, ki kodirajo beljakovine. 9 Trenutno je bilo registriranih 1424 človeških miRNA ob izdaji miRBase 17.0 (//microrna.sanger.ac.uk/).

Signalizacija onkogene poti RAS ima osrednjo vlogo pri pljučnem raku in približno 30% pljučnih rakov aktivira mutacije v tej kaskadi. 10 Vse več raziskav je razkrilo, da je aberantno izražanje miRNA povezano z začetkom in razvojem NSCLC, 11 in spremembami RAS signalizacije. Na primer, v tkivih raka pri bolniku z NSCLC so opazili znižanje vrednosti miRNA - jev let-7 , ki običajno zniža nivo ekspresije RAS z neposredno vezavo na 3'UTR RAS mRNA, 12 . Obnovitev izražanja let-7 je zavirala rast rakavih celic, kar kaže na to, da zmanjšanje let-7 povzroči prekomerno izražanje RAS in je glavni posrednik karcinogeneze NSCLC.

Nedavne študije iz naše skupine so odkrile miRNA, ki zavirajo tumor, in molekularne poti, ki jih obvladujejo pri različnih človeških rakih. 13, 14, 15, 16, 17, 18 Ker je malo raziskav o vlogi miRNA v pljučnem SCC-ju, smo poskušali identificirati tumorsko supresivne miRNA na podlagi našega pljučnega-SCC izraza podpisa. Osredotočili smo se na miR-133a , ki je bila v našem podpisu najpomembnejša regulirana miRNA, in zagotavljamo dokaz, da deluje kot zaviralec tumorja, ki zavira širjenje rakavih celic. Za identifikacijo ciljnih genov, ki jih ureja miR-133a , smo izvedli tudi gensko ekspresijsko analizo in ugotovili več kandidatnih genov, kot je kompleks, povezan z aktinom protein 2/3 , podenota 5, 16 kDa ( ARPC5 ) in glutation S-transferaza pi 1 ( GSTP1 ). Vpogled v povezavo med tumorsko supresivno miR-133a in njihovimi ciljnimi onkogenimi mrežami bi lahko izboljšal naše razumevanje molekularnega mehanizma karcinogeneze pljuč in SCC.

Materiali in metode

Klinični vzorci pljuč-SCC in celična kultura pljuč-SCC

Od bolnikov v univerzitetni bolnišnici Chiba (Chiba, Japonska) med letoma 2004 in 2007 je bilo odvzetih 25 parov primarnega tkiva pljuč-SCC in ustreznih normalnih vzorcev tkiv (klinične značilnosti bolnikov s pljučnim SCC so prikazane v tabeli 1). V kirurških vzorcih so bila normalna tkiva oddaljena od središča raka. V sosednjih tkivih, vgrajenih v parafin, niso bile odkrite nobene rakave celice. Pisno soglasje je bilo od vsakega pacienta, ki je pred operacijo odobril darovanje tkiva za raziskave, pridobil pisno soglasje po protokolu, ki ga je odobril institucionalni pregledni odbor univerze Chiba. Vzorci so bili potopljeni v RNAlater (Qiagen, Valencia, Kalifornija, ZDA) in shranjeni pri –20 ° C, dokler RNA ni bila ekstrahirana. Človeške celične linije pljuč-SCC, PC10 in H157, smo gojili v mediju RPMI1640, dopolnjenem z 10% fetalnim govejim serumom v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO2 pri 37 ° C.

Tabela polne velikosti

Izolacija RNA

Skupno RNA smo izolirali z reagentom TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu s proizvajalčevim protokolom. Koncentracije RNK smo določili z UV spektrofotometrom, celovitost molekul pa smo preverili z gel elektroforezo. Kakovost RNA je bila potrjena z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, ZDA).

miRNA izraz podpisa pljuč-SCC

Vzorci tkiv, ki so bili uporabljeni za miRNA presejanje nizke gostote, so bili odvzeti pri petih bolnikih s pljučnimi SCC (preglednica 1; številka bolnikov 1–5). vzorce izražanja miRNA smo ocenili z uporabo TaqMan LDA Human microRNA Panel v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, ZDA). Test je bil sestavljen iz dveh korakov: generiranje cDNA z reverzno transkripcijo in TaqMan PCR test v realnem času. Opis PCR-ja v realnem času in seznam človeških miRNK najdete na spletni strani podjetja (//www.appliedbiosystems.com). Analiza relativnih podatkov o ekspresiji miRNA je bila izvedena z uporabo programske opreme GeneSpring GX različice 7.3.1 (Agilent Technologies) po navodilih proizvajalca. Za zmanjšanje kandidatov po globalni normalizaciji neobdelanih podatkov je bila uporabljena presečna vrednost P <0, 05. Po globalni normalizaciji je bila z RNU48 opravljena dodatna normalizacija.

Zrela transfekcija miRNA in majhno moteče zdravljenje z RNA

Zrele molekule miRNA, predhodniki miRNA Pre-miR; ( hsa-miR-133a ; ID pre-miR: AM10413 in negativna kontrolna miRNA; P / N: AM17111, Applied Biosystems), majhna moteča RNA; si- ARPC5 (P / N: HSS145450 in HSS145450, Invitrogen), si- GSTP1 (P / N: s194475 in s194476, Applied Biosystems) in negativni kontrolni siRNA (Stealth RNAi Negative Control Medium GC Duplex; 12935-300, Invitrogen) inkubiramo z Opti-MEM (Invitrogen) in lipofektaminskim RNAiMax reagentom (Invitrogen). Učinkovitost transfekcije Pre-miR v celičnih linijah je bila potrjena na podlagi zmanjšanja mRNA PTK9 po transfekciji z miR-1, kot je opisano prej. 13, 14

Test celične proliferacije

Celice smo transficirali z 10 n M miRNA ali siRNA z reverzno transfekcijo in jih posadili v 96-jamice na 3x103 celice na jamico. Po 72 in 96 h smo celično proliferacijo določili s testom XTT z uporabo celičnega proliferacijskega kompleta II (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemčija). 14, 15 Izmerili smo tristranske vdolbinice za vitalnost celic v vsaki skupini zdravljenja.

Iskanje ciljnih genov za miR-133a

Za identifikacijo ciljnih genov miR-133a smo izvedli zaslon na celotnem genomu v dveh pljučno-SCC celičnih linijah, PC10 in H157, ki sta bili okuženi z miR-133a . Profili ekspresije so bili ustvarjeni z uporabo Oligo-microarray Human 44 K (Agilent Technologies) iz okuženih celic in primerjali z miRNA-negativnim kontrolnim vzorcem. Postopki hibridizacije in izpiranja so bili izvedeni, kot je predhodno opisano. 19 Niz smo skenirali s paketom Packard GSI Lumonics ScanArray 4000 (Perkin Elmer, Boston, MA, ZDA). Podatke smo analizirali s pomočjo matrične programske opreme DNASIS (Hitachi Software Engineering, Tokyo, Japonska), ki je intenzivnost signala za vsako točko pretvorila v besedilno obliko. Analizirali smo razmerja log 2 srednje in odštete intenzitete ozadja. Podatki iz vsake raziskave mikroarrame so bili normalizirani z globalno metodo normalizacije. 19

Predvideni ciljni geni in semenska območja njihovega miRNA veziva so bili raziskani z uporabo TargetScan (izdaja 5.1, //www.targetscan.org/). Zaporedja predvidenih zrelih miRNA smo potrdili z uporabo miRBase (sprostitev 17.0, //microrna.sanger.ac.uk/).

Količinski RT-PCR v realnem času

CDNA prvega niza je bila sintetizirana iz 1 µg celotne RNA z uporabo kompleta za povratno transkripcijo cDNA visoke zmogljivosti (Applied Biosystems). Za gensko specifične PCR izdelke smo neprestano testirali z uporabo PCR sistema v realnem času 7900-HT v skladu s protokolom proizvajalca. Začetni korak PCR je bil sestavljen iz 10-minutnega zadrževanja pri 95 ° C, čemur je sledilo 40 ciklov 15-sekcijske denaturacije pri 95 ° C in 1-minutno žarjenje / podaljšanje pri 63 ° C. Sonde in primerji TaqMan za ARPC5 (P / N: Hs00271722_m1), GSTP1 (P / N: Hs00168310_m1) in GUSB (P / N: Hs99999908_m1) kot notranji nadzor so bili pridobljeni iz Applied Biosystems (Assay-On-Demand Gene Expression Products) . Ekspresijske ravni miR-133a (ID analize: 002246) so bile analizirane s TaqMan kvantitativnim PCR v realnem času (TaqMan MicroRNA Test; Applied Biosystems) in normalizirane na RNU48 (Test ID: 001006). Vse reakcije smo izvedli v treh izvodih in vključevali negativne kontrolne reakcije, ki jim primanjkuje cDNA.

Western blot

Celice smo pobrali 72 ur po transfekciji in pripravili lizate. S pomočjo SDS-PAGE smo 50 μg beljakovin iz vsakega lizata ločili na mini-PROTEAN TGX (Tris-Glycine eXtended) prednastavljeni geli (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) in prenesli na membrane PVDF. Imunobloting smo izvedli z razredčenim (1: 500) monoklonskim protitelesom ARPC5 (ab51243; Abcam, Cambridge, Velika Britanija), monoklonskim protitelesom GSTP1 (# 3369; Cell Signaling, Danvers, MA, ZDA) ali protitelesom GAPDH (ab8245, Abcam) notranji nadzor. Membrana je bila oprana in inkubirana s kozjim proti zajecom ali proti mišjim konjugatom IgG (H + L) –HRP (Bio-Rad). Specifični kompleksi so bili vizualizirani s pomočjo ehochemiluminescence (Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit # 170-5070, Bio-Rad) in stopnjo izražanja vsakega proteina smo ocenili s programom ImageJ (ver.1.44; //rsbweb.nih.gov/ij/in/x) .html).

Statistična analiza

Razmerje med obema skupinama in številčnimi vrednostmi, dobljenimi z RT-PCR v realnem času, smo analizirali z neparametričnim Mann-Whitney-jevim testom ali seznanjenim t -testom. Razmerje med tremi spremenljivkami in številčnimi vrednostmi smo analizirali z Mannronijevim prilagojenim testom Mann – Whitney U, prilagojenim Bonferroni; neprilagojena statistična raven pomembnosti P <0, 05 je ustrezala Bonferronijevi prilagojeni ravni P <0, 0167. Spearmanov rang test je bil uporabljen za oceno razmerja med relativnimi nivoji izražanja miR-133a , ARPC5 in GSTP1 mRNA. Vse analize so bile izvedene z uporabo Expert StatView (različica 4, SAS Institute Inc., Cary, NC, ZDA).

Rezultati

Identifikacija reguliranih miRNA v pljučnem SCC s podpisom izražanja miRNA

Ocenili smo nivo ekspresije zrele miRNA v petih parih normalnih tkiv in pljuč-SCC s podpisom izražanja miRNA. Po normalizaciji z RNU48 smo izbrali 24 bistveno znižanih miRNK in nato izbrali 21 miRNA, saj je bila njihova sprememba krat manjša od 0, 5 (tabela 2). Med njimi je bil miR-133a najbolj znižan in je bil izbran za nadaljnje preučevanje.

Tabela polne velikosti

Izražanje miR-133a v kliničnih vzorcih pljuč in SCC ter vpliv transfektantov miR-133a na celično proliferacijo v PC10 in H157

Kvantitativni RT-PCR matične zanke je pokazal, da je bila stopnja izražanja miR-133a v 20 vzorcih pljučnega SCC (Tabela 1; številka bolnikov 6–25) v primerjavi z običajnimi tkivi ( P <0, 0001, slika 1a) znatno zmanjšana.

Image

miR-133a deluje kot zaviralec tumorja v pljučnem SCC. ( a ) Ekspresijska stopnja miR-133a je bila v tumorskih tkivih znatno znižana v primerjavi z netumorskimi tkivi. RNU48 je bil uporabljen kot notranji nadzor. ( b ) Proliferacijo rakavih celic smo določili s testom XTT v celičnih linijah PC10 in H157. XTT test smo izvedli 72 in 96h po transfekciji 10n M miR-133a ali miR-nadzora in pokazali pomembno inhibicijo celične proliferacije v miR-133a transfektantih v primerjavi s kontrolami. * P <0, 05.

Slika v polni velikosti

Za raziskovanje funkcionalne vloge miR-133a smo izvedli študije o povečani funkcionalnosti pri miRNA transfektantih. XTT test je pokazal pomembno inhibicijo celične proliferacije v transfektantih miR-133a v primerjavi s transfektanti, ki kontrolirajo miR (% sposobnost preživetja celic, 72 h; PC10; 67, 1 ± 2, 3 in 100, 0 ± 2, 7, H157; 54, 2 ± 3, 6 in 100, 0 ± 3, 9 96 ur oziroma PC10; 54, 9 ± 2, 3 in 100, 0 ± 2, 7, H157; 62, 2 ± 3, 6 in 100, 0 ± 3, 1, P <0, 05, slika 1b).

Ekspresijsko profiliranje identificira znižane gene v transfektatih miR-133a

Za nadaljnji vpogled v to, kateri geni uravnavajo miR-133a , smo izvedli analizo genske ekspresije po miR-133a transfekciji v primerjavi z negativnimi kontrolami v celicah PC10 in H157. Vrednosti signala, manjše od 1000, iz surovih podatkov v transfektantih, ki jih nadzorujejo miR, niso bili nadalje upoštevani. Skupaj 116 genov je bilo v transfektantih miR-133a manj kot -1, 0 v primerjavi s kontrolo (v zgornji tabeli 3 je prikazano največ 30 genov). Program TargetScan je pokazal, da je imelo 14 genov predvidena ciljna mesta miR-133a v svojem 3'UTR med 30 najbolj reduciranimi geni. Vnosi iz podatkov o mikroračunih so bili odobreni z omnibusom za gensko ekspresijo in jim je bila dodeljena pristopna številka genetske ekspresije Omnibus, GSE26032.

Tabela polne velikosti

Stopnje ekspresije kandidatnih ciljnih genov miR-133a v kliničnih vzorcih pljuč-SCC

Izmerili smo nivo ekspresije mRNA najboljših štirih kandidatnih genov v 20 kliničnih vzorcih pljuč-SCC s kvantitativnim RT-PCR v realnem času. Dva gena, z aktinom povezan kompleks protein 2/3, podenota 5, 16kDa (ARPC5) in glutation S-transferaza pi 1 (GSTP1), sta bila v območju tumorja znatno regulirana ( P = 0, 019 in P = 0, 0022, sliki 2a in b, zgornja). Druga dva gena ( TAGLN2 in LASS2 ) nista bila regulirana na tumorskem območju pljučnega SCC (podatki niso prikazani). Med ARPC5 - miR-133a ( r = −0, 23 in P = 0, 16, slika 2a, spodaj) in pomembna obratna korelacija med GSTP1 - miR-133a ( r = −0, 65 in P <0, 0001, ni bilo nobene pomembne obratne korelacije., Slika 2b, spodnja).

Image

Povečana stopnja ekspresije ARPC5 in GSTP1 mRNA v pljučnih SCC kliničnih vzorcih. ( a ) Ravni ekspresije mRNA ARPC5 v tumorskih tkivih in ne tumorskih tkivih v 20 kliničnih vzorcih (zgoraj). Ekspresija ARPC5 mRNA je bila v tumorskih tkivih znatno povišana. Povezava med izražanjem ARPC5 in miR-133a je bila raziskana v kliničnih vzorcih (nižje). Trend obratne korelacije je bil prepoznan med izražanjem ARPC5 in miR-133a . ( b ) Ravni ekspresije mRNA GSTP1 v tumorskih tkivih in ne-tumorskih tkivih v 20 kliničnih vzorcih (zgoraj). Ekspresija GSTP1 mRNA je bila znatno povišana v tumorskih tkivih. Povezava med izražanjem GSTP1 in miR-133a je bila raziskana v kliničnih vzorcih (nižje). Med izražanjem GSTP1 in miR-133a je bila prepoznana pomembna obratna korelacija.

Slika v polni velikosti

Utišanje ARPC5 in GSTP1 s transfekcijo miR-133a

Izvedli smo študije o povečanju funkcije z uporabo miR-133a transfektantov, vrednosti ARPC5 in GSTP1 mRNA in beljakovin pa sta bili izrazito znižani v primerjavi s kontrolo (sliki 3 in 4).

Image

miR-133a uravnava ekspresijo ARPC5 v celičnih linijah pljuč-SCC. ( a ) V mRNA -133a -transfektiranih PC10 celicah sta bili izrazito potisnjeni nivo mRNA in proteina ARPC5 . Notranji nadzor je bil GUSB za RT-PCR, GAPDH pa za Western blot analizo. ( b ) V mRNA -133a -transfektiranih celicah H157 sta bili znatno potisnjeni mRNA in proteinska ekspresija ARPC5. * P <0, 05. Prikazana so predvidena ciljna mesta miR-133a v ARPC5 v območju 3'UTR (desno).

Slika v polni velikosti

Image

miR-133a uravnava GSTP1 ekspresijo v pljučnih SCC celičnih linijah. ( a ) V mRNA -133a -transfektiranih PC10 celicah sta bili znatno potisnjeni mRNA in proteinska ekspresija GSTP1. Notranji nadzor je bil GUSB za RT-PCR, GAPDH pa za Western blot analizo. ( b ) V mRNA -133a -transfektiranih celicah H157 sta bili znatno potisnjeni mRNA in ekspresija proteinov GSTP1. * P <0, 05. Prikazana so predvidena ciljna mesta miR-133a v GSTP1 v območju 3'UTR (desno).

Slika v polni velikosti

Vpliv utišanja ARPC5 in GSTP1 na razmnoževanje celic v PC10

Za pregled funkcionalne vloge ARPC5 in GSTP1 smo izvedli študije izgube funkcije v celicah PC10 z uporabo dveh različnih si-RNA za vsak gen. Nivo mRNA in ekspresijo proteinov ARPC in GSTP1 je bilo z vsakim zdravljenjem s si-RNA izrazito potisnjeno (slike 5a, b, 6a in b). XTT test je pokazal pomembno inhibicijo proliferacije celic v vsakem od si-RNA transfektantov v primerjavi s kontrolami (% celicne vitalnosti, si- ARPC5 ; 55, 6 ± 4, 9, 35, 6 ± 2, 1 in 100, 0 ± 9, 3, P <0, 0001; Slika 5c, si- GSTP1 ; 60, 9 ± 4, 6, 69, 3 ± 7, 6 in 100, 0 ± 9, 0, P <0, 0001; Slika 6c).

Image

Učinki utišanja ARPC5 na pljučno-SCC celični liniji PC10. ( a ) Ekspresija mRNA ARPC5 je bila močno potisnjena z dvema si- ARPC5 transfektantoma. GUSB je bil uporabljen kot notranji nadzor. ( b ) Ekspresija proteina ARPC5 je bila potisnjena z dvema si- ARPC5 transfektantoma. GAPDH je bil uporabljen kot notranji nadzor. ( c ) Proliferacijo rakavih celic smo določili s testom XTT 72h po transfekciji. XTT test je pokazal pomembno inhibicijo celične proliferacije dveh si- ARPC5 transfektantov. * P <0, 0001.

Slika v polni velikosti

Image

Učinki utišanja GSTP1 v pljučno-SCC celični liniji PC10. ( a ) Ekspresija mRNA GSTP1 je bila znatno potisnjena v dveh si- GSTP1 transfektantih. GUSB je bil uporabljen kot notranji nadzor. ( b ) Ekspresija proteina GSTP1 je bila potisnjena z dvema si- GSTP1 transfektantoma. GAPDH je bil uporabljen kot notranji nadzor. ( c ) Proliferacijo rakavih celic smo določili s testom XTT po 72 urah po transfekciji. XTT test je pokazal pomembno inhibicijo celične proliferacije pri dveh si- GSTP1 transfektantih. * P <0, 0001.

Slika v polni velikosti

Diskusija

MiRNA so nov razred majhnih RNA, ki uravnavajo ekspresijo številnih genov, veliko število raziskav pa je pokazalo, da se miRNA aberantno izraža v številnih vrstah človeških rakov. Številni raziskovalci so poročali tudi o 20 MiRNA izraženih profilih NSCLC. 21, 22 Vendar nekaj raziskav opisuje podobno analizo pljučnega SCC, ene najbolj smrtonosnih malignosti na svetu, s 5-letno stopnjo preživetja po kurativni operaciji približno 60%. Večje razumevanje molekularnih poti, ki so vključene v karcinogenezo pljuč in SCC, bi pomagalo izboljšati diagnozo in zdravljenje bolezni.

Preiskali smo 665 miRNA iz pljučnega SCC in parnih normalnih epitelijskih vzorcev z uporabo RT-PCR-ja matične zanke in identificirali 21 miRNA, ki so bili regulirani v tkivih raka. Za merjenje učinkovitosti podpisa izraza miRNA smo primerjali naše podatke s seznami znižanih miRNA iz preteklih poročil. V naši raziskavi je bilo ugotovljeno več genov ( miR-30a-3p , miR-126 , miR-574 -3p in miR-320 ) in nedavnega poročila, ki je analiziralo profile miRNA na pljučih-SCC. 23 Naši podatki kažejo, da lahko regulirane miRNA delujejo kot tumorski supresorski geni in prispevajo k onkogenezi pljuč-SCC. Prihodnji poskusi, ki analizirajo funkcijo miRNA regulacije izražanja genov v pljučnem SCC, bodo verjetno izboljšali razumevanje mehanizmov, na katerih temelji ta smrtonosna bolezen.

V našem podpisu izražanja je miR-133a najbolj znižana miRNA, in študije izražanja so pokazale zmanjšanje ravni miR-133a pri številnih vrstah raka. 14, 18, 24, 25, 26, 27 Zanimivo je, da so nedavna poročila o ploščatoceličnem karcinomu glave in vratu (SCC) in ezofagealnem SCC pokazala, da se miR-133a tudi v tkivih raka bistveno zmanjša v primerjavi z običajnim epitelijem. 14, 17 Funkcionalni pomen miR-133a smo raziskovali s pomočjo SCC glave in vratu, ezofagealnih SCC in celičnih linij mehurja, naši podatki pa so pokazali, da je obnavljanje izražanja miR-133a zaviralo širjenje, invazijo in migracijo rakavih celic ter neposredno uravnavalo aktinsko oz. sorodni geni, kot so FSCN1 , LASP1 in TAGLN2 . 13, 14, 18, 28 Opredelitev miR-133a regulacije poti raka bi lahko dala nov vpogled v potencialne mehanizme karcinogeneze ljudi.

V tej raziskavi smo se osredotočili na funkcionalni pomen miR-133a , ker vloga te miRNA v pljučnem SCC ni dobro razumljena. Najprej smo potrdili zmanjšanje izražanja miR-133a v kliničnih vzorcih. Nadalje pokažemo, da obnova miR-133a v rakavih celicah znatno zavira širjenje celic, kar kaže na to, da miR-133a deluje kot zaviralec tumorja pri pljučnem SCC in drugih rakih. Za raziskovanje mrežastega RNA-miRNA omrežja v pljučih-SCC smo sprejeli metodo analize genske ekspresije v celicah PC10 in H157 z uporabo transfektantov miR-133a za identifikacijo onkogenih tarč. Izbrali smo štiri kandidatne ciljne gene, transgelin 2 ( TAGLN2 ), z aktinom povezan protein2 / 3 kompleks, podenota 5, 16kDa ( ARPC5 ), homolog LAG1, ceramid sintazo 2 ( LASS2 ) in glutation S-transferaza pi 1 ( GSTP1 ), iz naš izrazni profil. Dva gena ( ARPC5 in GSTP1 ) sta uregulirana v tkivih raka in sta bila podrobno analizirana.

To je prvo poročilo, da ARPC5 v celicah pljuč-SCC uravnava miR-133a . Aktin se hitro oblikuje kot odziv na posebne celične signale, ki se v kompleksu Arp2 / 3 zbližajo za regulacijo sestavljanja. 29 Človeški kompleks Arp2 / 3 je sestavljen iz sedmih podenot, vključno z ARPC5, najmanjšo podenoto. 30 Ugotovili smo, da je povečana ekspresija gena ARPC5 v pljučnem SCC korelirala z zmanjšanimi nivoji miR-133a . Iskanje baze podatkov TargetScan je pokazalo, da je ARPC5 kandidatna tarča miR-133a . ARPC5 mRNA in ekspresija beljakovin sta zmanjšana v transfektantnih celičnih linijah miR-133a , kar kaže, da miR-133a uravnava ravni ARPC5 v celicah pljuč-SCC. Utišanje ARPC5 je zmanjšalo širjenje rakavih celic v celicah PC10, kar kaže, da bi ARPC5 lahko prispeval k razvoju raka na pljučih. Tako ARPC5 deluje kot onkogen in lahko predstavlja nov diagnostični marker in terapevtski cilj za zdravljenje pljučnega SCC. Poleg tega smo predhodno opravili analizo genske ekspresije na celotnem genom z uporabo miR-133a transfektantov, pridobljenih iz celičnih linij raka glave in vratu ter celic raka mehurja. Glede na izraze podpisov je ARPC5 kandidat miR-133a tarč v rakavih celicah. Ta rezultat kaže, da je pot miR-133a - ARPC5 splošno pomembna za rakave celice. Ti podatki o mikroračunih so registrirani v zbirki podatkov o zbirki gena Expression Omnibus, pristopnih številkah GSE 19717, 20028 in 26032.

GSTP1, ki je član družine GST encima, v procesu razstrupljanja katalizira konjugacijo elektrofilov na glutation. 31 GSTP1 protein ima več kritičnih vlog v normalnih in neoplastičnih celicah, vključno s presnovo ksenobiotikov faze II, stresnimi odzivi, signalizacijo in apoptozo. Pri številnih vrstah raka, vključno s pljučnim rakom, so opazili prekomerno izražanje GSTP1. 32, 33, 34 Pred kratkim smo pokazali, da miR-133a deluje kot zaviralec tumorja in neposredno uravnava GSTP1 pri raku glave in vratu SCC 16 in raku mehurja. 35 Ta analiza kaže, da se podobna ureditev pojavlja v pljučnem SCC in lahko kaže, da je uravnavanje GSTP1 s tumorskim supresorjem miR-133a običajna značilnost človeškega SCC.

Za zaključek je bilo zmanjšanje miR-133a pogost dogodek v rakavih celicah pljuč-SCC. miR-133a lahko deluje kot zaviralec tumorja in uravnava ARPC5 in GSTP1 . Oba vzorca sta bila uravnana v vzorcih pljučnega SCC. MiR-133a - urejene nove poti raka lahko prinesejo nov vpogled v molekularne mehanizme v pljučnem SCC in bi lahko prispevale k razvoju nove terapevtske strategije za bolezen.

Pridružitve

Omnibus genetske ekspresije

  • 20028
  • 26032
  • GSE 19717
  • GSE26032