Sistematična analiza regulatornih funkcij mikrornas v presnovi lipidov piščanca v jetrih | znanstvena poročila

Sistematična analiza regulatornih funkcij mikrornas v presnovi lipidov piščanca v jetrih | znanstvena poročila

Anonim

Predmeti

  • Reja živali
  • Genska ekspresija
  • miRNA

Izvleček

Uspešnost polaganja je pri kokoših pomembna gospodarska lastnost, na ta fiziološki proces pa v veliki meri vpliva delovanje jeter. Jetrke kokoši na stopnjah, starih 20 in 30 tednov, so raziskovali z uporabo zaporedja naslednje generacije, da bi ugotovili razlike v ekspresijskih profilih mikroRNA. V primerjavi z 20-tedenskimi kokošmi je bilo pri 30-tednih pri 67-ih navzdol urejenih in 13 up-reguliranih mikroRNK značilno različno izraženo (napačna stopnja odkritja, FDR ≤ 0, 05) (SDE). Ugotovili smo tudi 13 različno izraženih (DE) mikroRNA z znižanjem in 6 navzgor. miR-22-3p in miR-146b-5p, ki imata kritično vlogo pri presnovi lipidov sesalcev, sta pokazala najbolj obilno izraznost in največjo spremembo pregiba. Skupaj 648 potencialnih ciljnih genov mikroRNA SDE je bilo ugotovljenih z integrirano analizo mikroRNA in genov DE, pridobljenih v prejšnjih sekvencah RNA, vključno s FADS1 , FADS2, ELOVL6 in ACSL5 , ki so kritični regulatorji, povezani s presnovo lipidov. Bioinformatske analize so pokazale, da so bili ciljni geni obogateni predvsem v procesih metabolizma, povezanih z lipidi. To delo ponuja prvo študijo vzorcev izražanja jetrnih mikroRNA med 20- in 30-tedenskimi kokošmi. Ugotovitve lahko služijo kot temeljni vir za razumevanje podrobnih funkcij mikroRNA v molekularnih regulacijskih sistemih presnove lipidov.

Uvod

Odlaganje jajc je najpomembnejša gospodarska lastnost kokoši nesnic, na ta fiziološki proces pa v veliki meri vpliva delovanje piščančjih jeter. Številne študije so pokazale, da je večina genov in njihovih produktov, ki sodelujejo v presnovi jetrnih lipidov pri perutnini, podobna tistim pri sesalcih; vendar se funkcije številnih teh genov in njihovih proizvodov pri perutnini v veliki meri razlikujejo od njihovih kolegov pri sesalcih 1, 2, 3, 4 . Poleg tega je prejšnja študija pokazala, da so perutninske vrste med evolucijskim procesom v primerjavi z sesalci izgubile nekatere genske gene, vključene v presnovo lipidov (npr. Rezinin, TNFα , PAI-1 ). Čeprav so raziskave RNA-seq na piščančjih jetrih poročale o različno eksprimiranih (DE) genih, ki delujejo predvsem na uravnavanje metabolizma lipidov med fazami pred in do končnega polaganja 6, imajo vloge molekularnih regulatorjev (npr. MikroRNA, lncRNA) na jetrnih lipidih perutnine metabolizem zahteva nadaljnjo preiskavo.

MikroRNA (miRNA) so razred endogenih, evolucijsko ohranjenih majhnih nekodirajočih RNA, ki so dolge približno 22 nukleotidov (nt). Z značilno strukturo lasne zanke 8 se miRNA sprva prepisujejo iz primarnih transkriptov, ki so kodirani bodisi v intergenih območjih bodisi v prekrivajočih se genih (neproteinsko kodiranje ali kodiranje) kot primarni miRNA. Na splošno miRNA delujejo z mRNA, da opravljajo svoje funkcije. Na primer, pri vrstah sesalcev je bilo ocenjeno, da samo 1–5% genskih prepisov kodira miRNA, do 60% genov pa miRNA neposredno ali posredno uravnava. Trdimo, da lahko ena miRNA uravnava ekspresijo sto mRNA, izražanje ene mRNA pa lahko hkrati uravnava sto milijonov miRNA 9 . Z drugimi besedami, miRNA lahko igrajo kritično vlogo z izgradnjo omrežij prefinjenih regulativnih sistemov nadzora v organizmih 10 .

Vse več študij je pokazalo, da miRNA služijo kot pomembni regulatorji pri presnovi v jetrih. Na primer, miR-122 za jetra, specifične za jetra, ki se obilno izražajo v jetrih, lahko modulira metabolizem jetrnih beljakovin, tako da usmeri uravnavanje prenašalcev kationskih aminokislin 1 11 . MiR-122 lahko uravnava tudi jetrne maščobne kisline in sintezo holesterola z zatiranjem izražanja genov, ki sodelujejo v biosintezi holesterola 12, 13 . Poleg tega lahko miR-33 deluje v jetrni presnovi z uravnavanjem izločanja holesterola in presnove lipoproteinov visoke gostote z usmerjanjem na podskupino kasete, ki veže ATP, član 1 in kasetno poddružino, ki veže ATP, G 14 . MiR-33 lahko tudi zavira prevajanje več prepisov, ki kodirajo beljakovine, ki sodelujejo v β-oksidaciji maščobne kisline, kar bi lahko zato zmanjšalo razgradnjo maščobnih kislin 15 . Post-transkripcijsko utišanje genov, odvisnih od MiRNA, je zdaj prepoznano kot pomemben element presnove lipidov 12, 16, 17 .

Fiziološki proces odlaganja jajčec perutnine zahteva presnovo, povezano z lipidi, kar bi lahko bilo močno povezano s presnovo lipidov, ki jih posreduje jetrna miRNA. Glede na to, da so kokoši med 20 in 30 tedni, ki so dosegli svoje spolno dozorevanje, in da je najpomembnejša fiziološka razlika med njimi, ali odlagajo jajca ali ne, smo domnevali, da bi se izražanje jetrnih miRNA v kokoših nesnicah razlikovalo od tista pred polaganjem. Tako smo sprejeli tehnologijo miRNA-seq za raziskovanje izraženosti jetrnih miRNA pri 20- in 30-tedenskih starih kokoših. Za razjasnitev regulativnih vzorcev miRNA in njihove mreže z domnevnimi ciljnimi geni smo izvedli integrirano analizo pomembnih različno eksprimiranih (SDE) miRNA in DE jetrnih genov, pridobljenih iz prejšnje publikacije 6 . Raziskovanje molekularnega regulacijskega mehanizma metabolizma lipidov v piščancih ne bi moglo samo prispevati k poglobljenemu razumevanju njegovega regulativnega sistema, temveč bi bilo koristno tudi pri prizadevanjih za izboljšanje zmogljivosti perutnine pri odstranjevanju jajc.

Rezultati

Analiza zaporedja sRNA

Povzetek podatkov o ujemajočih se številih nekodiranih RNA bere in majhne RNA (sRNA) v jetrih 20- (L20) in 30-tedenskih (L30) knjižnic je predstavljen v tabelah 1 in 2. Skupno je bilo 57.648.491 in 62.999.617 neobdelanih odčitkov iz knjižnic L30 oziroma L20. Po odstranitvi očitkov očitkov smo dobili 54.285.329 (L30) in 61.393.581 (L20) čistih odčitkov, ki smo jih uporabili za naslednje analize. Med čistimi odčitki se je v povprečju 13.747.104 zaporedij iz knjižnic L20 in 8.645.866 zaporedij iz knjižnic L30 popolnoma presodilo v sekvenco piščančjih genomov (tabela 1). Povprečno število odčitanih sRNA je bilo 1.470.389 in 2.186.271 v knjižnicah L20 in L30. Povprečno število miRNA, ki so jih pripomnili v miRBase 21.0 ( Gallus gallus ), je bilo 32.782 (L20) in 22.931 (L30), povprečno število znanih miRNK pa je bilo 408 in 383 v knjižnicah L20 in L30 (tabela 2).

Tabela polne velikosti

Tabela polne velikosti

Sekvencirane sRNA so bile preslikane v številne javne baze podatkov (podrobnosti glej Materiali in metode) in razvrščene med rRNA, znane miRNA (miRNA v miRBase 21.0), misc_RNA, Mt_rRNA, Mt_tRNA, mRNA, kodirajoče z beljakovinami, psevdogeni, retrotransoni, retrotransoni snoRNA (slika 1). Več kot 80% sekvenc sRNA so miRNA. Večina odčitkov sRNA je bila v obeh skupinah dolga 21–24 nt (slika 2). 22-nt sRNA so bili najbolj obilni, predstavljali so več kot 40% celotnega odčitavanja zaporedja. Tej skupini so sledili 21, 23 in 24 nt sRNA. Te vrednosti spadajo v tipičen razpon miRNA za izdelke, ki izvirajo iz Dicerja. Za vsako knjižnico je bila globina zaporedja večja od 10 M, s čimer je dosegla nasičenost (dodatna slika S1). Poleg tega smo identificirali nove miRNA z velikostjo od 21 do 23 nt, 5 'konci večine pa so bili sestavljeni iz uridina (U).

Image

L20, knjižnica, pripravljena iz jeter piščancev, starih 20 tednov; L30, knjižnica, pripravljena iz jeter piščancev, starih 30 tednov.

Slika v polni velikosti

Image

Slika v polni velikosti

Analize piščančjih jetrnih miRNA

Za identifikacijo miRNA SDE, ki imajo lahko pomembne regulativne vloge pri piščančjih jetrih, smo primerjali vzorce izražanja jetrnih miRNA pri 20 in 30 tednih. Od 996 zrelih miRNA Gallus gallus v miRBase 21.0 je bilo 565 predstavljenih v knjižnicah L20 in L30 (dodatna tabela S1). Vseh 10 najbolj razširjenih miRNA so bile izrazito izražene (FDR <0, 05) v knjižnicah piščančjih jeter L30 (slika 3). Devet od teh je bilo v L30 nižje regulirano v primerjavi z L20; izjema je bil let-7f-5p, ki je bil nadzorovan (1, 29-krat). MiR-22-3p (-1, 33-krat) je imel v obeh knjižnicah najvišjo stopnjo izražanja, sledila je miR-148a-3p (−1, 35-krat), medtem ko je miR-146c-5p (-3, 69-krat) največji pregib -zamenjati.

Image

** FDR ≤ 0, 05.

Slika v polni velikosti

Med 71 novimi miRNA je bilo 60 najdenih v L30, 67 pa v L20. Poleg tega jih je bilo med knjižnicami razdeljenih 56. V primerjavi z L20 je bilo v L30 ugotovljenih 19 DE novih miRNA ( P ≤ 0, 05), vključno s 13 miRNA navzdol in 6 navzgor reguliranih miRNA. Nova miRNA gga01 je bila v L30 znižana z največjo spremembo pregiba (-17, 97-krat), nekateri novi miRNA pa so bili odkriti le v eni od knjižnic (dodatna tabela S2); vendar so bile stopnje izražanja večine novih miRNA relativno nizke, razen gga56. Med 565 znanimi miRNA-ji je bilo med knjižnicami 80 SDE (FDR ≤ 0, 05); 67 je bilo regulirano navzdol, 13 pa je bilo nadrejeno, pri čemer je bil L20 kot izhodišče (dodatna tabela S3). MiRNA SDE z velikimi spremembami krat so bile v L30 znižane, vključno z miR-146b-5p (−8, 50-krat), miR-24-3p (-7, 39-krat), miR-146a-5p (−5, 96- krat), miR-221-5p (-5, 85-krat), miR-7b (-5, 35-krat), miR-147 (-5, 11-krat), miR-20-5p (-4, 59-krat) in miR- 140b-5p (-4, 57-krat). Vseh sedem ohranjenih družin je bilo DE s P ≤ 0, 05, vključno z let-7 (let-7a, -7b, -7c, -7f, -7g, -7i, -7j in -7k), miR-130 (miR-130a in -130b), miR-146 (miR-146a, -146b in -146c), miR-15 (miR-15a, -15b in -15c), miR-181 (miR-181a in -181b), miR-29 (miR-29a, -29b in -29c) in miR-30 (miR-30a, -30b, -30c, -30d in -30e). Vsi člani družin miR-15, miR-181 in miR-29 so bili v L30 nižji v primerjavi z L20, druge družine pa so bile člane, ki so bili nadzorovani ali navzdol.

qRT-PCR validacija zaporednih podatkov

Za potrditev zanesljivosti podatkov zaporedja, dobljenih s sekvenciranjem z visoko prepustnostjo, smo izvedli qRT-PCR matične zanke. Sedemnajst miRNA z različnimi nivoji izražanja je bilo izbranih naključno; ena ni bila bistveno izražena (miR-1786), druga je šestnajst miRNA SDE, vključno s šestimi nadzorovanimi (miR-375, -3523, -125b-5p, -130b-5p, -456-3p in -460a-5p ) in deset navzdol reguliranih miRNA (miR-146b-5p, -24-3p, -451, -126-5p, -2188-5p, -33-3p, -22-3p, -148a-3p, -21 -5p in -10a-5p) (slika 4). Rezultati so pokazali, da so bili izrazi izbranih miRNA pomembni in skladni z rezultati sekvenciranja miRNA (slika 4).

Image

* P ≤ 0, 05; ** P ≤ 0, 01; *** P ≤ 0, 001. Sprememba preklopa> 0 označuje up-regulacijo; sprememba pregiba <0 pomeni spodnjo regulacijo.

Slika v polni velikosti

Integrirane analize in funkcionalne opombe

Za identifikacijo kandidatnih bioloških procesov, v katere so lahko vključene identificirane miRNA, smo integrirali ciljne gene miRNA SDE in genov, pridobljenih iz podatkov transkriptoma piščančjih jeter 6 .

MiRNA SDE je bilo možno usmerjenih na skupno 648 genov DE. Z najvišjo bogato ekspresijo je bilo napovedano, da znižanje reguliranega miR-22-3p usmeri na devet genov (slika 5), ​​vključno z ELOVL maščobno kislinsko elongazo 6 ( ELOVL6 ), dolgoverižno sintezo acil-CoA ( ACSL5 ) in perilipin 2 ( PLIN2 ), ki so ključni regulativni dejavniki pri presnovi lipidov. MiR-101-3p (−2, 1-krat) in miR-15c-5p (−1, 4-krat) sta imela največ ciljnih genov, sledili so miR-15a, miR-16-5p, miR-214, miR-16c-5p, in miR-181b-5p (dodatna tabela S4), in vse te miRNA so bile v L30 v primerjavi z L20 vse regulirane.

Image

Slika v polni velikosti

Vsi ciljni geni so bili dodeljeni izrazom GO z uporabo DAVID. V kategoriji bioloških procesov je bilo ugotovljenih šestnajst izrazito obogatenih izrazov ( P ≤ 0, 05). Z opombo so bili določeni nekateri ciljni geni, ki so vključeni v biosintetični lipidni proces, presnovo organofosfata, presnovo fosfolipidne biosintetike in fosfolipida ter presnovo maščobnih kislin in biosintezo, vse to pa je tesno povezano z regulacijo lipidnega metabolizma. (Slika 6). Mitohondrij, endoplazemski retikulum, kompleks fosfoinozidov 3-kinaza in membranski splav so bili pomembni pojmi za obogatitev v kategoriji celičnih komponent. V kategoriji molekularnih funkcij so bile znatno obogatene tudi majhna aktivnost regulatorja GTPaze, fosfatazna aktivnost, aktivnost proteinske tirozin-fosfataze in aktivnost fosfotransferaze za druge substituirane fosfatne skupine. Zlasti je bilo bistveno obogatenih pet poti, vključno z biosintezo steroidov, presnovo glicerofosfolipida, biosintezo poti nenasičenih maščobnih kislin, biosintezo pantotenata in CoA ter signalno potjo PPAR, ki so pomembne za presnovo lipidov (tabela 3). Poleg tega lahko miRNA v piščančjih jetrih aktivno urejajo druge poti, povezane z biosintezo pantotenata in CoA, presnovo aminokislin, metabolizma fruktoze in manoze in presnovo zdravil.

Image

Predstavljeni so le bistveno obogateni izrazi ( P ≤ 0, 05) GO v biološkem procesu, celičnih komponentah in kategorijah molekularnih funkcij.

Slika v polni velikosti

Tabela polne velikosti

Za boljše razumevanje interakcij smo vizualizirali integrirane mreže miRNA-mRNA med SDR miRNA in njihovimi ciljnimi geni, ki so bili znatno obogateni na zgoraj omenjenih petih poteh (slika 7). Rezultati so pokazali, da je bilo devet genov, ki so bili obogateni v metabolizmu glicerofosfolipida, posebej targetirane z miRNA, ki so regulirane navzdol, pet od teh devetih genov pa je bilo usmerjeno z miR-128-3p. Deaturaza maščobne kisline FADS2 , ki katalizira začetni korak desaturacije pri sintezi polinenasičenih maščobnih kislin z dolgimi verigami, je bila vključena tako v signalno pot PPAR kot v biosintezo nenasičenih maščobnih kislin in je bila ciljno usmerjena z nižjo regulirano miRNA miR-30c -1-3p. V nasprotju s tem je bil FADS1 , ki kodira desaturazo 1 maščobne kisline, ki je vključena v biosintezo nenasičenih maščobnih kislin, usmerjenih v šest mirensko reguliranih miRNA, vključno z miR-365-3p, -218-5p, -181a-5p, - 181b-5p, -29a-3p in -23b-3p. Geni, ki kodirajo fosfatidilserin sintazo 1 ( PTDSS1 ) in maščobno kislinsko elongazo 5 ( ELOVL5 ), so vključeni v presnovo glicerofosfolipida in biosintezo nenasičenih maščobnih kislin. Ta dva gena sta bila tarča najvišjega števila miRNA, vključno z miR-101-3p in miR-21-3p. MiR-1456-5p so bili usmerjeni tako na gene sterolne O-aciltransferaze 1 ( SOAT1 ) kot na razvejane verige aminokislin transaminaze 1 ( BCAT1 ). CYP7A1 , ki je cilj miR-1662 in kodira citokrom P450, ki katalizira stopnjo omejevanja hitrosti pretvorbe holesterola v žolčne kisline 18, je bil vključen v signalno pot PPAR. Poleg tega je bila s presnovo glicerofosfolipida povezana 1-acilglicerol-3-fosfatna O-aciltransferaza 3 ( AGPAT3 ), še ena tarča miR-1662, ki kodira O-aciltransferazo. Poleg tega domnevni ciljni geni družinskih članov miR-30 (miR-30a, -30b, -30d, -30e in -30c) kodirajo beljakovine, ki sodelujejo v presnovi glicerofosfolipida, biosintezi nenasičenih maščobnih kislin, biosintezi pantotenata in CoA in PPAR signalna pot.

Image

Krog označuje miRNA, kvadrat pa ciljni gen. Zelena označuje regulacijo navzdol, rdeča pa zgornjo regulacijo. Črka v oklepaju za ciljnim genom označuje kratico sorodnih poti na naslednji način: biosinteza Pa-pantotenata in CoA, B-biosinteza nenasičenih maščobnih kislin, metabolizem G-glicerofosfolipida, signalna pot PP-PPAR in biosinteza S-steroida .

Slika v polni velikosti

Diskusija

Jajca so pomemben prispevek in bogat vir lipidov, kot so holesterol in fosfolipidi 19 . Pri piščancih se več kot 90% sinteze de novo maščobnih kislin pojavlja v jetrih 20, 21, 22 ; zato presnova jeter kritično vpliva na uspešnost odlaganja piščančjih jajc. Čeprav so mehanizme presnove lipidov v jetrih temeljito preučili pri piščancih, je treba v celoti določiti osnovne molekularne regulacijske mehanizme in vlogo miRNK. V trenutni študiji smo uporabili tehnologijo miRNA-seq za raziskovanje profila izražanja jetrnih miRNA, povezanih z mehanizmom metabolizma lipidov pri piščancih v dveh različnih fizioloških fazah (20 in 30 tednov). Kolikor nam je znano, je to prva študija profiliranja piščančjih jeter, ki se ukvarja z miRNA, ki je raziskala vlogo miRNK jeter in njihovih domnevnih ciljnih genov DE v presnovi lipidov.

V tej raziskavi je bilo ugotovljenih 565 znanih in 71 potencialnih novih miRNA. Med njimi naj bi bilo miR-22-3p kot najbolj obilno mireno SDE namenjeno ACSL5 , ELOVL6 in PLIN2, ki so vsi vključeni v presnovo lipidov. ACSL5 igra pomembno vlogo pri delitvi maščobnih kislin na trigliceride 23, njegovo zaviranje pa lahko povzroči zmanjšanje tvorbe lipidnih kapljic, ki jih povzroča maščobna kislina 24 . V nasprotju s tem brisanje ELOVL6 25 in PLIN2 26 zatrjujeta kopičenje trigliceridov v jetrih. Poleg tega je miR-22-3p kritičen pri razvoju maščobnih jeter pri miših z modulacijo ciljnih genov na način, ki lahko povzroči povečanje kopičenja lipidov pri testiranju na človeških celicah hepatoma (HepG2) 27, 28, 29, 30, 31, kar pomeni, da bi lahko bil pomemben regulator pri pospeševanju sinteze lipidov v piščancih. Poleg tega nekateri drugi miRNA, kot so miR-148a, miR-122, miR-21-5p, Let-7f-5p, miR-26a-5p, miR-126-5p, miR-30d in miR-10a- 5p, so bili tudi zelo obilni v piščančjih jetrih. Prejšnja študija je pokazala, da so miR-148a, miR-122 in miR-21-5p najpogostejši miRNA v prašičjih jetrih 32 . Zaviranje izražanja miR-122 lahko zmanjša raven holesterola v plazmi in zmanjša hitrost sinteze jetrnih maščobnih kislin in holesterola v mišjih jetrih 12 .

Tako 20- kot 30-tedenska plast kokoši sta dosegli spolno zorenje, najpomembnejša fiziološka razlika med skupinama pa je, ali odlagajo jajca. Zato lahko spremembe v ekspresijskih profilih miRNA / mRNA med plastmi kokoši med 20 in 30 tedni v glavnem pripišemo proizvodnji jajc. Vendar nismo mogli popolnoma izključiti možnosti, da so nekatere spremembe povezane z običajnim razvojem in / ali spremembami v okolju, čeprav smo bili strogo nadzorovani. Dejansko je bilo o nekaterih bistveno spremenjenih miRNA prej omenjenih, da so povezane z rastjo in razvojem pri drugih vrstah. Na primer, miR-126, -30d in -10a so pomembni za razvoj prašičjih mišic 33, miR-148a pa posreduje miogeno diferenciacijo s ciljanjem na ROCK1 34 . Ti ohranjeni miRNA-ji lahko igrajo podobne vloge pri piščancih, čeprav še ne vemo.

Med identificiranimi miRNA v tej raziskavi je bilo v 30-tedenski fazi odkritih 80 znanih SDE in 19 DE novih miRNA v primerjavi z 20-tedensko fazo, štiri od teh novih miRNA pa smo izključno opazovali v 30-tedenski fazi. Po eni strani je veliko teh znanih miRNA SDE povezanih z metabolizmi lipidov v jetrih. Na primer, miR-146b-5p (znan tudi kot miR-146b) se nahaja na intergeničnem območju (22, 683, 802–22, 683, 906) na piščančjem kromosomu 6 in ga najdemo pri večini vretenčarjev (vključno s sesalci). MiR-146b-5p je zelo ohranjen in ima 30-tedensko spremembo v višini 8, 50-krat v primerjavi z 20 tedni. Ta sprememba lahko neposredno vpliva na presnovo lipidov v piščančjih jetrih, ker je prejšnja študija pokazala, da lahko uravnava adipogenezo 35 . V skladu s spremembo pregiba miR-146b-5p je bil miR-24-3b pri piščancih, starih 30 tednov, reguliran (-7, 39-krat). MiR-24-3b se lahko odzove na dramatično povečanje kopičenja lipidov v piščančjih jetrih, starih 30 tednov, in se zato lahko uravnava za vzdrževanje homeostaze lipidov v jetrih. Prejšnja študija je pokazala, da lahko prekomerna ekspresija miR-24 posredno spodbudi kopičenje lipidov v jetrih in hiperlipidemijo ter da lahko njegovo zmanjšanje povzroči lipogenezo 36 . Po drugi strani pa so imele nove miRNA precej nizke stopnje izražanja, z izjemo gga56, ki je bil razmeroma visoko izražen. Nova miRNA gga01 je bila v fazi največjega polaganja izrazito znižana z največjo spremembo pregiba (-17, 97-krat). Čeprav bi bilo mogoče določiti funkcije teh novih miRNA, je lahko izziv, vendar so preiskave osnovnih mehanizmov upravičene.

Jetrne miRNA bi lahko imele tudi pomembno vlogo pri uravnavanju različnih funkcij jeter 27 . Prejšnja študija je pokazala, da se miRNA povezujejo z energijskim metabolizmom prek modulacije glukoze in lipidne homeostaze prek vezave na njihove ciljne gene 37 . Na primer, miR-33a in miR-33b skupaj s svojim ciljnim genom, ki kodira SREBP, sta pomembna regulatorja transkripcije genov, vključenih v lipogenezo 38, in regulatorja homeostaze holesterola in presnove maščobnih kislin 39 . Drug primer je miR-122, ki je jetrno specifična miRNA, ki uravnava oksidacijo jetrnih maščobnih kislin in stopnjo sinteze maščobnih kislin in holesterola 12, 40 .

Poleg tega je bilo 648 napovedanih ciljnih genov miRNA SDE opomeno s GO izrazi in podvrženo analizi obogatitve GO. To je pokazalo, da so nekateri od teh genov v glavnem vključeni v regulacijo presnove lipidov. Biosinteza steroidov, metabolizem glicerofosfolipida, biosinteza nenasičenih maščobnih kislin in signalna pot PPAR so bili znatno obogateni presnovni procesi, povezani z lipidi.

Mreža miRNA-mRNA je razkrila interakcijo med molekulami. ELOVL6 in ACSL5 proteini, ciljni geni miR-22-3p, sodelujejo v biosintezi nenasičenih maščobnih kislin in signalnih poti PPAR. Ti rezultati kažejo, da je miR-22-3p lahko vključen v kopičenje lipidov z vezavo na ciljne gene, ki sodelujejo v presnovi piščančjih jetrnih maščob. CYP7A1 , ki je povezan s pretvorbo holesterola v žolčne kisline in homeostazo holesterola 18, 41, in AGPAT3 sta bila predvidena, da bosta ciljala miR-1662. Različica AGPAT3 je ena od dejavnikov pri kroženju glicerofosfolipidov in sfingolipida 42, protein AGPAT3 pa sodeluje pri vgradnji dokozaheksaenojske kisline (DHA) v fosfolipide 43 . Pet možnih tarč miR-128-3p je bilo prisotnih v biološki poti metabolizma glicerofosfolipida. Člani družine miR-30 so pomembni pozitivni regulatorji diferenciacije adipocitov v modelu matičnih celic iz človeškega tkiva 44 . FADS1 in FADS2 igrata pomembne katalitične vloge v kritičnih korakih procesa biosinteze dolgih verig polinenasičenih maščobnih kislin 45, 46 . V tej študiji je bil FADS1 usmerjen v miR-365-3p, miR-218-5p, miR-181a-5p, miR-181b-5p, miR-29a-3p in miR-23b-3p, medtem ko je bil FADS2 usmerjen v miR-30c-1-3p. Poleg tega SOAT1 (znan tudi kot acil-koencim A: holesterola aciltransferaza 1, ACAT), domnevni ciljni gen miR-1456-5p, sintetizira estre maščobne kisline holesterola z uporabo maščobnih kislin, ki se sprostijo iz membranskih fosfolipidov 47 . Vendar pa je za podrobno delovanje teh miRNA na njihovih ciljnih genih v omrežju potrebna nadaljnja preiskava, da bi razjasnili uravnavanje presnove piščančjih jeter v piščancih.

Če povzamemo, so ugotovitve v tej raziskavi skladne z našo hipotezo, da se izrazni profil miRNA razlikuje med kokošmi, starimi 20 in 30 tednov. Nekatere od opredeljenih miRNK SDE bi lahko služile kot kritični regulatorji pri povezovanju ključnih poti (npr. Steroidna biosinteza, biosinteza poti nenasičenih maščobnih kislin), vključenih v metabolizem, povezan z lipidi. Še več, ugotovitve kažejo tudi na neposredno vlogo miRNA, posredovane post-transkripcijsko uravnavanje metabolizma lipidov v piščancih v fazi največjega polaganja. To delo je prineslo študijo profila izražanja jetrnih miRNK med 20- in 30-tedenskimi pripadniki pomembne vrste gospodarskega modela in je lahko temeljni vir za nadaljnje študije na to temo in druga sorodna področja.

Metode

Izjava o etiki

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s protokolom, ki ga je odobril institucionalni odbor za nego in uporabo živali (IACUC) kmetijske univerze Henan 6 .

Zbiranje vzorcev in ekstrakcija RNA

Eksperimentalne živali, uporabljene v tej raziskavi, so bile kitajska domača pasma, znana kot Lushi kokoši nesnice. Vse piščance so vzgajali v kletkah v istem okolju z vodo in hrano ad libitum . Zdrave posameznike so vzorčili naključno in jih nato zaklali v fazi 20 tednov (pred polaganjem) in 30 tednov (vrh polaganja). Jetrno tkivo smo takoj zbirali, snažno zamrznili v tekočem dušiku in ga shranili pri –80 ° C. Majhna RNA (sRNA), ki se uporablja za sekvenciranje, je bila v skladu z navodili proizvajalca ekstrahirana z izolacijskim kompletom mirVana ™ miRNA (Ambion, Austin, TX, ZDA). Kakovost in količina celotne RNA sta bili ocenjeni s sistemom bioanalizatorja Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). za nadaljnjo analizo je bila izbrana sRNA z razmerji 28S / 18S v razponu od 1, 8 do 2, 0 in vrednosti integritete RNA med 8, 0 in 10, 0. Vzorci RNA so bili do nadaljnje uporabe shranjeni pri –80 ° C.

Gradnja majhne knjižnice RNA in zaporedje RNA

Izdelovali smo šest knjižnic sRNA piščančjih jeter med 20-tedenskimi (L20-1, L20-2 in L20-3) in 30-tedenskimi (L30-1, L30-2 in L30-3) piščančjimi jetri ter jih pripravili za analiza zaporedja. Na kratko smo 3 'in 5' RNA adapterje zaporedno ligirali na skupno RNA s T4 RNA ligazo. Nato smo dobili cDNA z reverzno prepisanim PCR iz liganih RNA. Nato smo cDNA amplificirali s PCR. Amplifikacijske produkte z ustreznimi dolžinami smo očistili iz agaroznega gela, da smo konstruirali knjižnice sekvenc, ki so bile sekvencirane z uporabo enočitljivega 1 × 36 nt multipleksnega postopka na analizatorju gena IIx (Illumina, Inc., San Diego, Kalifornija, ZDA) po navodila proizvajalca.

Analize podatkov

Surovi odčitki so bili filtrirani s pomočjo orodja za predobdelavo Fastx (fastx_toolkit-0.0.13.2) za odstranjevanje nastavkov zaporedja, nizkokakovostni odčitki (vključno z odčitki z neznanimi bazami N), odčitki manjši od 18 nt in odčitki z osnovno kakovostjo manj kot 10. Čisti odčitki iz vsakega vzorca so bili poravnani na sekvence v miRBase bazi 21.0 s pomočjo komercialne programske opreme CLC Genomics Workbench 5.5 (biološka tehnologija CLC, Aarhus, Danska). Ne-preslikani odčitki so bili označeni in razvrščeni z iskanjem nekodirajočih serij RNA (piRNA, tRNA, snoRNA, rRNA in snRNA) v GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov/) in bazah podatkov ncRNA Ensembl (//asia.ensembl.org/index.html) kot tudi družine RNA v Rfamu (//rfam.sanger.ac.uk/) in RNK, ki delujejo s Piwi v piRNA Bank (//pirnabank.ibab.ac .in /). Največje dovoljeno število neusklajenosti sta bili dve podlagi, med poravnavo pa je bilo dovoljeno skrajševanje ali podaljševanje na dveh koncih na obeh koncih zaporedja. Orodje miRCat v kompletu orodij sRNA 48 je bilo uporabljeno za napovedovanje novih miRNA. Preostale zaporedne sNNA zaporedne sRNA so bile poravnane glede na sekvenco piščančjih genom 49, genomske sekvence, ki vsebujejo sRNA, pa so bile uporabljene za napovedovanje struktur las s programom Mfold (//mfold.rna.albany.edu). Za nove kandidatne miRNA se štejejo le sekvence, ki kažejo značilno strukturo lasnih zatičev, ki so bile izražene vsaj v treh vzorcih. Ko so bili zaključeni vsi koraki za pripombe, smo knjižnice zaporedja izvedli analize porazdelitve in nasičenosti po velikosti.

Analize diferencialnih izrazov

Ravni izražanja označenih miRNA so bile ocenjene iz podatkov o sekvenciranju Illumina na podlagi prepisov na milijon čistih odčitkov (TPM) 50 . Izračunane vrednosti TPM smo uporabili za primerjavo ravni izražanja miRNA med dvema fiziološkima stadijama (20 in 30 tednov). Sprememba pregiba za vsako miRNA med obema fazama je bila izračunana kot L30 / L20 z uporabo TPM vrednosti. Paket 51 DEGseq R je bil uporabljen za analizo različno izraženih miRNA. P- vrednosti so bile določene s Fisherjevim testom, FDR pa je bil uporabljen za prilagajanje praga vrednosti P- vrednosti za več preskusov. MiRNA s FDR ≤ 0, 05 smo identificirali kot SDE miRNA 52 .

Kvantitativni PCR v realnem času (qRT-PCR)

Ekspresijske ravni nekaterih naključno izbranih miRNA so bile potrjene z qRT-PCR. RNA, uporabljena za PCR, je bila v skladu z navodili proizvajalca reverzno prepisana s pomočjo cDNA kompleta za sintezo (TaKaRa, Dalian, Kitajska). Relativne stopnje izražanja miRNA so bile količinsko opredeljene z uporabo metode SYBR Green v instrumentu LightCycler ® 96 (Roche Applied Science). Kot notranji nadzor je bila uporabljena piščančja majhna jedrska RNA U6. Primerki zanke, ki se uporabljajo za qRT-PCR, so bili naročeni pri Shanghai GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kitajska). Postopek PCR amplifikacije je bil naslednji: 95 ° C 3 minute; 40 ciklov 95 ° C 12 sek, 61 ° C 40 sec, 72 ° C 30 sec; 10 min podaljška pri 72 ° C. Vse reakcije so potekale v treh ponovitvah, relativne stopnje izražanja pa so bile izračunane po metodi 2 -ΔΔct 53 . Pomen nivoja izražanja je bil določen s t-testom (neparno, dvorezno) z uporabo Graphpad Prism 5 (Graphpad Software, San Diego, CA). P- vrednosti ≤ 0, 05 so bile ocenjene kot statistično pomembne 17 .

Napoved in funkcionalne analize miRNA ciljnih genov

Potencialni ciljni geni identificiranih znanih miRNA piščančjih SDE so bili predvideni z uporabo računalniškega algoritma miRanda z načelom TargetScan 54, 55 . Za vsako miRNA SDE, ki je bila v 30-tedenski skupini navzgor nadzorovana, so bili potencialni ciljni geni predvideni med nizko reguliranimi geni DE v podatkih RQ-seq iz 30-tedenske skupine 56 . Podobno so potencialni ciljni geni DE znižanih SDE miRNA v 30-tedenski skupini napovedovali od up reguliranih genov DE.

V analizi bioinformatike smo uporabili vse potencialne ciljne gene DE miRNA SDE. Funkcionalna analiza opomb je bila izvedena z uporabo spletnih orodij DAVID 57 za prepoznavanje obogatene Kjotske enciklopedije genov in genov (KEGG) poti 58 in izrazov za gensko ontologijo (GO), skupino funkcionalno povezanih genov in izraze za označevanje grozdov za velike sezname genov 59 . V analizo so bili vključeni samo GO izrazi in poti s P- vrednostmi ≤ 0, 05. Omrežne interakcije med miRNA in z njimi povezanimi ciljnimi geni so bile izvedene s pomočjo paketa "igraph" v R (različica 3.2.2) 60 .

Pristopne številke

Vsi nabori podatkov o miRNA-seriji Illumina, ki podpirajo rezultate tega članka, so bili poslani Nacionalnemu centru za biotehnološke informacije (NCBI) Gen Expression Omnibus (GEO) pod pristopno številko GSE74242.

Dodatne informacije

Kako citirati ta članek : Li, H. et al . Sistematična analiza regulativnih funkcij mikroRNA v presnovi lipidov piščanca v jetrih. Sci. Rep. 6, 31766; doi: 10.1038 / srep31766 (2016).

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.