Strukturna analiza človekovih 2'-o-riboze metiltransferaz, ki sodelujejo pri tvorbi kapnice mrna | narave komunikacije

Strukturna analiza človekovih 2'-o-riboze metiltransferaz, ki sodelujejo pri tvorbi kapnice mrna | narave komunikacije

Anonim

Predmeti

  • Presnova RNA
  • Strukturna biologija

Izvleček

5 'pokrovček človeške selitvene RNK vsebuje 2'- O- metilacijo prvega in pogosto drugega prepisanega nukleotida, ki je pomemben za njegovo predelavo, prevajanje in stabilnost. Nedavno so bili ugotovljeni človeški encimi, ki metilirajo te nukleotide, imenovane CMTr1 in CMTr2. Vendar strukture teh encimov in njihovi mehanizmi delovanja ostajajo neznani. V tej študiji rešujemo kristalne strukture aktivne katalitične domene CMTr1 v kompleksu z dajalcem metilne skupine in omejenim oligoribonukleotidom, s čimer razkrijemo mehanizem specifičnega prepoznavanja omejene RNA. Ta mehanizem se bistveno razlikuje od virusnih encimov in tako zagotavlja okvir za njihovo specifično ciljanje. Na osnovi kristalne strukture CMTr1 se ustvari primerjalni model katalitične domene CMTr2. Ta model skupaj z mutacijsko analizo vodi do identifikacije ostankov, ki sodelujejo pri vezavi na dajalce RNA in metilne skupine.

Uvod

Messenger RNA (mRNA) vseh evkariontskih organizmov in številnih virusnih RNK ​​imajo 5 'strukturo pokrovčkov, ki je sestavljena iz N7-metilguanozina (m 7 G), ki je preko obrnjenega mostu 5'-5 'trifosfata povezan s 5'-terminalnim nukleozidom prepisa 1 . Ta struktura cap0 je bistvenega pomena za rast celic Saccharomyces cerevisiae 2 in preživetje celic sesalcev 3 . Cap0 je kritičen za interakcije mRNA z mnogimi jedrskimi in citoplazemskimi proteini in ima več vlog pri ekspresiji genov, vključno z izboljšanjem stabilnosti RNK, spajanjem, nukleocitoplazmatskim transportom in prevajanjem 4, 5 . V višjih evkariotih se mRNA in majhna jedrska RNA (snRNA) 5 ′ konca nadalje spreminjajo z metiliranjem riboze na prvem in drugem prepisanem nukleozidu (torej cap1 in cap2) 6 . Metilacije cap0 in cap1 so pri ljudeh prisotne na vseh molekulah mRNA, medtem ko približno polovica molekul z omejeno in poliadenilirano RNA vsebuje metilacijo cap2. SnRNA U1, U2, U4 in U5 se metilirajo na prvih dveh položajih 8 . Metilacije Cap1 in Cap2 v s2RNA U2 so potrebne za tvorbo spliceosomalnega E kompleksa in posledično za učinkovito spajanje pre-mRNA 9 .

Gostiteljske celice lahko neopažene RNA, kot so nanizanski virusni transkripti, zaznajo kot "nesebične", kar sproži protivirusni prirojeni imunski odziv s proizvodnjo interferonov 10 . Zato se je veliko virusov, ki se razmnožujejo v citoplazmi evkariotov, razvilo 2'- O- metiltransferaze (2'- O -MTaze), da bi avtonomno spreminjali svoje mRNA. Čeprav so strukture pokrovčkov RNA, ki izvirajo iz človeških in virusnih encimov, identične, so struktura in katalitični mehanizmi encimov, zakodiranih z virusom, vključeni v sintezo pokrovčne strukture RNA, drugačni od strukture gostiteljskih celic. Posledično so ti patogeni encimi, ki tvorijo pokrovčke, potencialne tarče protimikrobnih zdravil (kot je razvidno iz ref. 11). Nedavno je bilo ugotovljenih več močnih zaviralcev virusnih kap 1 MTaz, vendar je treba še vedno ugotoviti njihovo specifičnost in pomanjkanje strupenosti (na primer odsotnost interakcij s človeškimi encimi) 12 .

Do danes so določili številne strukture z visoko ločljivostjo virusnih RNA zapornih encimov, le nekaj pa jih predstavlja komplekse z RNA in osvetli specifično prepoznavanje pokrovčkov. Deloma je to, ker je ostala pomembna ozka grla razpoložljivost podlaga RNA s 5 'pokrovčki z določeno in primerno dolžino. Struktura pokrovitve virusa vakcinije MT1 VP39 je bila rešena kot trojni kompleks s S -adenozil-L-homocisteinom (SAH) in z omejeno RNA 13 . Številne strukture kap 1 MTaz iz flavivirusov so bile določene z različnimi analogi pokrovčkov, kar razkriva strukturo žepa, ki veže pokrov 14, 15 . Razvoj spojin, ki zavirajo virusne kap 1 MTaze, je bil močno omejen s pomanjkanjem strukturnih informacij o ustreznih človeških encimih, ki jih virusom specifična zdravila ne bi smela zavirati. Geni, ki kodirajo človeške MTaze cap1 in cap2 (to je CMTr1 in CMTr2), so odkrili šele pred kratkim 16, 17, kar omogoča podrobno biokemično in strukturno karakterizacijo njihovih produktov.

V tej študiji poročamo o kristalnih strukturah izolirane, funkcionalno aktivne katalitične domene CMTr1 v več oblikah, vključno s kompleksom z omejenim oligoribonukleotidom (m 7 GpppGAUC). Nadalje je predstavljen model katalitične domene CMTr2, vezane na cilj. Te strukture razkrivajo ključne razlike v vezavi pokrovčkov s človeškimi in virusnimi encimi, kar zagotavlja okvir za iskanje zaviralcev, ki so specifični za zaviralce MTase-MTase.

Rezultati

Analiza brisanja zgornjih MTases

Da bi razumeli prispevek posameznih domen k funkciji CMTr1 in CMTr2, smo ustvarili različice za brisanje vsakega proteina. Za CMTr1 je ena od variant (CMTr1 1–550 ) vsebovala katalitično domeno Rossmannove kratne MTase (RFM), G-obliž in jedrski lokalizacijski signal, druga varianta (CMTr1 550–835 ) pa je vsebovala preostali del karboksi-terminala ki obsega domene, ki so podobne gvanililtransferazi in WW (slika 1a). CMTr2 je bil razdeljen tudi na dva dela: amino-terminalni del s katalitično RFM domeno (CMTr2 1–430 ) in C-terminalni del z nekatalitično RFM domeno (CMTr2 430–770 ) (slika 2a). CMTr1 1–550 lahko veže substrat cap0-RNA in ga metilira, C-terminalna domena CMTr1, ki je podobna gvanililtransferazi, pa ni bistvena, vendar prispeva k aktivnosti MTase tega proteina (slika 3). Posamezne domene CMTr2 ne vežejo substrata in ne kažejo nobene kapaste MTase aktivnosti same ali če se mešajo skupaj kot ločeno prečiščene verige. Zato CMTr2 potrebuje obe domeni RFM v eni polipeptidni verigi za vezavo substrata in metilacijo.

Image

( a ) Sestava domene v celotnem CMTr1. Črtkane črte označujejo območje proteina (CMTr1 126–550 ), ki je prisoten v kristalni strukturi. Meje domene so označene s številkami ostankov. ( b ) Kristalna struktura CMTr1 126–550 v kompleksu z omejenim oligoribonukleotidom (m 7 GpppGAUC; obarvan rumeno) in SAM (zelena). Helice so prikazane oranžno, β-prameni so modri, zanke pa bele.

Slika v polni velikosti

Image

( a ) Sestava domene CMTr2. Črtkane črte označujejo del beljakovin, ki je bil modeliran na osnovi kristalne strukture CMTr1 126–550 . Meje domene so označene s številkami ostankov. ( b ) Homološki model katalitične domene CMTr2 v kompleksu z omejenim oligoribonukleotidom (m 7 GpppGGAA) in SAM. m 7 GpppGGAA in SAM sta obarvana rumeno in zeleno. Helice so prikazane oranžno, β-prameni so modri, zanke pa bele. Ostanki, ki so jih preučevali v poskusih z usmerjeno mutagenezo, so prikazani v sivih kroglah.

Slika v polni velikosti

Image

Analiza je bila izvedena za beljakovine v celotni dolžini in različice delecije CMTr1 ( a, b ) in CMTr2 ( c, d ). Beljakovine so bile prekomerno izražene in izolirane iz celic HEK 293 (bele palice) ali E. coli (siva palica). Proteinska varianta CMTr1 126–550 je bila izražena iz kristalizacijskega konstrukta. ( a, c ) MTase aktivnost. In vitro prepisane molekule RNA-GG z 32 P-označeno strukturo cap0 ( a ) ali cap01 ( c ) smo inkubirali z navedenimi encimi v prisotnosti SAM. RNA produkta smo prebavili z nukleazo P1 ( a ) ali RNazo T2 ( c ) in očistili z ekstrakcijo fenola / kloroforma in oborino z etanolom. Prebavne produkte raztopimo na 21% poliakrilamidnem / 8 M sečninskem gelu in jih po avtoradiografski vizualizaciji količinsko določimo. ( b, d ) Vezava podlage. In vitro prepisane molekule RNA-GG z 32 P-označeno strukturo cap0 ( b ) ali cap01 ( d ) so bile inkubirane z navedenimi encimi v prisotnosti SAH (produkta demetilacije SAM) in neprimerne, konkurenčne RNA za zaznavanje specifičnega substrata zavezujoče. Po 30 min inkubacije smo vzorce filtrirali skozi nitrocelulozno membrano in sprali z reakcijskim pufrom. RNA, vezana na membransko vezane proteine, smo vizualizirali z avtoradiografijo in kvantificirali. Signal negativne kontrole (to je vzorec z beljakovinami BAP) je bil odvzet od signala iz vzorcev s pokrovčkom MTases. Analize so bile izvedene v treh izvodih. Prikazani so relativna aktivnost / vezava v primerjavi z encimom celotne dolžine (nastavljeno na 100%) in sd.

Slika v polni velikosti

Struktura katalitične domene CMTr1

Da bi razjasnili mehanizem prepoznavanja in metilacije pokrovčkov s CMTr1, smo rešili njegovo kristalno strukturo v kompleksu z ligandi. V Escherichia coli smo izrazili več mutacijskih delecij in na koncu identificirali stabilno različico CMTr1, ki je vsebovala katalitično domeno (ostanki 126–550; podrobno opisani v dopolnilnih metodah). Encimatska aktivnost CMTr1 126–550 je bila potrjena in vitro (dodatna slika S1); posledično je bila ta različica proteina uporabljena v preskusih kristalizacije. Določili smo tri kristalne strukture katalitične RFM domene CMTr1: (i) nevezano obliko z ločljivostjo 2, 35 Å, (ii) tristranski kompleks s kofaktorjem S- adenozil metioninom (SAM) in analognim pokrovom mRNA (m 7 GpppG) pri Ločljivost 1, 9 Å in (iii) kompleks s SAM in omejenim oligoribonukleotidom pri ločljivosti 2, 7 Å (tabela 1). Tri strukture spadajo v vesoljske skupine I 422 (i), P2 1 (ii) in P1 z dvema molekulima beljakovin v asimetrični enoti (iii) in skupaj sestavljata štiri neodvisne določitve strukture beljakovin. Vsi štirje beljakovinski modeli so skoraj enaki in jih je mogoče prekrivati ​​s koreninskim srednjim odstopanjem (rmsd) med 0, 3 Å (struktura (ii) v primerjavi s (iii), 367 pari C-α atomov) in 0, 7 Å (struktura (i) v primerjavi s (iii) 336 parov C-α atomov). Strukturne razlike so omejene na manjše konformacijske spremembe več zank ob vezavi podlage (dodatna slika S2a). Kompleksna struktura (iii) z omejenim oligoribonukleotidom je prikazana na sliki 1b.

Tabela polne velikosti

Katalitična RFM domena CMTr1 prevzame istoimensko Rossmannovo naboro 18 . Jedro domene obsega značilen β-list s sedmimi prameni, obdanimi s šestimi α-vijačnicami (to je struktura, ohranjena pri skoraj vseh članih RFM superfamily). Periferne končnice, tako na N- kot C-termininih, spominjajo na strukture, ki jih najdemo v drugih MTazah, ki spreminjajo kapico, vključno z virusom vaccinia virusa VP39, ki deluje kot cap1 MTase 13, in bifunkcionalno domeno MTase cap0 / cap1 flavivirusov 19 . V resnici so virusne cap1 MTaze najbližja strukturna ujemanja katalitične domene CMTr1 glede na strežnik DALI 20 .

Vezava substrata in kofaktorja s katalitično domeno CMTr1

V strukturah (ii) in (iii) smo opazili natančno določene gostote elektronov za ligande (dopolnilna slika S3). Za oba kompleksa je kofaktor SAM vezan v globok žep, ki se nahaja na robu osrednjega β-lista med prameni 2, 3 in 4 (slika 1b). Vezava SAM je zelo podobna drugim RFM MTaz, kot sta protein NS5 iz dengue virusa 21 in VP39 protein iz vaccinia virusa 13 .

V strukturi CMTr1 126–550 v kompleksu s SAM in z omejenim oligoribonukleotidnim substratom (struktura (iii)) nukleinska kislina prevzame obliko L, z metiliranim gvanozinom (m 7 G), nameščenim v globok žep, in metiliranim nukleotid 1, ki se nahaja na upogibu molekule substrata (slika 1b). Preostanek mRNA izstopi iz mesta vezave skozi pozitivno nabit kanal na površini proteina (slika 4a in dodatna slika S4a, b). Z izjemo ostanka m 7 G pride do interakcij med beljakovinsko in fosfodiestersko hrbtenico nukleinske kisline. Pomanjkanje stikov med osnovami RNA in proteina CMTr1 kaže na to, da sta vezava in metilacija substrata neodvisno od zaporedja (slika 4c).

Image

( a ) Površinska reprezentacija CMTr1 126–550 z elektrostatičnim potencialom (± 5 kT / e, rdeče-negativno; modro-pozitivno). Zaprti oligoribonukleotid in SAM so prikazani v predstavitvi palice. ( b ) Stereo prikaz interakcij med proteinom in m 7 Gppp. Preostanek RNA (štirje ostanki ribonukleotida) izpustimo zaradi jasnosti. ( c ) Stereo pogled na omejeno vezavo oligoribonukleotida. Molekule vode, ki posredujejo pri vezanju, so prikazane kot majhne rdeče krogle.

Slika v polni velikosti

m 7 G vezava in konformacija sta v bistvu enaki med strukturo CMTr1 z analognim pokrovčkom (struktura (ii)) in z omejenim oligoribonukleotidom (struktura (iii)), vendar se položaj γ-fosfata razlikuje. To verjetno izhaja iz dejstva, da je prvi prepisani nukleotid m 7 GpppG neurejen in v strukturi ni viden. Dno žepa m 7 G, ki se veže, tvori stranska veriga K203, aminska skupina tega ostanka pa tvori vodikovo vez z 2'-OH skupino riboze m 7 G (slika 4b). Stranska veriga E373 tvori zložljivo interakcijo z aromatičnim obročem m 7 G. Dodatne interakcije, ki stabilizirajo m 7 G del omejenega oligoribonukleotida, so med D207 in N 1 m 7 G baze ter med N374 in N 2 od osnova. R218, Q376 in D439 delujejo s trifosfatnim mostom. Pomen m 7 G deleža za vezavo in prepoznavanje substrata potrjuje opazovanje, da se molekule RNA brez 5 'pokrovnega gvanozina ne metilirajo s CMTr1 in človeške kapaste MTaze običajno delujejo le na omejenem 5' koncu RNA ( Dopolnilna slika S5).

V strukturi (iii) je ključni element, ki stabilizira substrat m 7 GpppGAUC tri guanidinijeve skupine argininskih ostankov 218, 235 in 436, ki vse skupaj tvorijo sendvič za zlaganje, ki v kopico podlage v obliki črke L postavi kopico pozitivnih nabojev molekula (slika 4c). Grozd deluje tako neposredno kot prek molekul vode s fosfatnimi skupinami trifosfatnega veznika in nukleotidi 2 in 3 RNK. Dodaten ostanek, ki stabilizira hrbtenico RNA, je K239, ki skupaj z D364 in K404 tvori aktivno mesto. Osnova nukleotida 1 naslanja na površino, ki jo tvori glavna veriga proteina (ostanki 366–368) in z njo deluje prek stikov van der Waals. Amidna skupina stranske verige N234 tvori vodikovo vez z 2'-OH skupino riboze drugega prepisanega nukleotida.

Model katalitične domene CMTr2 v kompleksu z RNA

Za lažje primerjave med CMTr1 in CMTr2 smo s primerjalnim modeliranjem zgradili strukturni model katalitične domene CMTr2 1–423 s pomočjo strukture CMTr1 126–550 kot predlogo (slika 2b; podrobnosti glej v metodi). Po napovedovalcu točnosti modela MetaMQAP 22 predvideni odklon povprečnega korenine kvadratnega odmika modelirane CMTr2 1–423 katalitične domene glede na (trenutno neznano) strukturo znaša ~ 2, 3 Å, kar kaže na dobro splošno kakovost modela. Ta ocena temelji na položajih C-α; zato je treba atomske podrobnosti modela (na primer skladnosti stranskih verig) ravnati previdno. RNA substrat CMTr2 1–423 je bil modeliran tudi s primerjalnim pristopom, pri čemer je predloga CMTr1 126–550 podlaga (glej Metode za podrobnosti). Domnevali smo, da bi morale regije, ohranjene med CMTr1 126–550 in CMTr2 1–423, na zelo podoben način vplivati na funkcionalno ustrezne nukleotidne ostanke (m 7 G pokrovček in ciljno ribozo) (dopolnilna slika S4c-e). Zato je modeliranje RNA substrata CMTr2 1–423 vključevalo vnos enega ostanka med 5–5 'trifosfat in metilirano ribozo, da se odraža premik v registru med ciljem CMTr1 in CMTr2.

Vezava substrata in kofaktorja s katalitično domeno CMTr2

Primerjave eksperimentalno določene strukture trojnega kompleksa katalitične domene CMTr1 126–550 z njegovim RNA substratom z ustreznim modelom za katalitično domeno CMTr2 1–423 razkrivajo v bistvu enako aktivno mesto, obdano s spremenljivimi ostanki (dopolnitev sl. S4e). Področje identitete med obema encimoma zajema večino žepa, ki veže SAM, celotno aktivno mesto (vključno s katalitično triado KDK) in dno žepa, ki veže ganozin. Razlike so vidne v regiji, za katero se predvideva, da bo v CMTr2 1–423 vključila ostanek N1 substrata RNA, kar lahko razloži različne posebnosti CMTr1 in CMTr2 (metilacija ostanka RNA 1 ali 2). Model katalitične domene CMTr2 1–423 ni dovolj natančen, da bi lahko špekuliral o atomskih podrobnostih prepoznavanja N 1. Vendar se modelirana konformacija RNA dobro ujema z eksperimentalnimi informacijami. CMTr2 lahko metilira substrate, ne glede na prisotnost metilacije kapano gvanozina ali N 1 riboze 17 . V našem modelu so te metilne skupine izpostavljene topilu in jih protein ne stika. Poleg tega se zdi, da ostanek N1 medsebojno deluje z N 3. Med zmanjševanjem energije se je konformacija N1 konvergirala in je tvorila cis osnovni par Hoogsteen – Hoogsteen z N 3. V alternativnih modelih bi lahko N1 prisilili, da se obrne za 180 stopinj in interakcijo z N3 prek sladkornega roba. Ta značilnost modela kaže na to, da lahko nekatere kombinacije baznih parov v 5-končnem zgornjem delu RNA lažje sprejmejo CMTr2 1-423 aktivno mesto kot druge, kar predstavlja osnovo za specifičnost encimskih substratov.

Analiza mutageneze CMTr1 in CMTr2

Za potrditev funkcionalnega pomena aminokislinskih ostankov, za katere se predvideva, da so kritični za vezavo substrata in encimsko aktivnost MTaza človeške kapice, smo izvedli analizo mutageneze. Najprej sta bili kot kontrolo za potrditev metode pripravljeni dve različici CMTr1. Pričakovano je bilo, da bo alaninska substitucija s K203, ki neposredno deluje s pokrovko RNA, močno vplivala na vezavo in aktivnost kaplinske MTaze. R228 se nahaja v bližini substrata z omejeno mRNA, vendar z njim ne deluje, zato smo pričakovali, da substitucija R228A ne bo vplivala na aktivnost ali vezavo. Najprej smo analizirali aktivnost vezave in MTase dveh kontrolnih variant CMTr1 z omejenim oligoribonukleotidom (cap0-RNA-GG) kot substratom. Kot je bilo pričakovano, substitucija K203A v CMTr1 močno vpliva tako na vezavo kot na aktivnost encima, medtem ko R228A ne (Slika 5), ​​kar kaže, da metoda lahko razlikuje med ostanki, ki medsebojno delujejo s substratom, in tistimi, ki ne.

Image

Analiza je bila izvedena za polne dolge divje vrste in različice z enim nadomestkom CMTr1 ( a, b ) in CMTr2 ( c, d ). ( a, c ) Vpliv posameznih aminokislinskih nadomestkov na aktivnost MTaze. In vitro prepisane molekule RNA-GG z 32 P-označeno strukturo cap0 ( a ) ali cap01 ( c ) smo inkubirali z navedenimi encimi v prisotnosti SAM. RNA produkta smo prebavili z nukleazo P1 ( a ) ali RNazo T2 ( c ) in očistili z ekstrakcijo fenola / kloroforma in oborino z etanolom. Prebavne produkte raztopimo na 21% poliakrilamidnem / 8 M sečninskem gelu in jih po avtoradiografski vizualizaciji količinsko določimo. ( b, d ) Vpliv posameznih aminokislinskih substitucij na vezavo substrata. In vitro prepisane molekule RNA-GG z 32 P-označeno kapico ( b ) ali cap01 ( d ) strukturo smo inkubirali z navedenimi encimi v prisotnosti SAH. Po 30-minutni inkubaciji smo vzorce filtrirali skozi nitrocelulozno membrano in sprali z reakcijskim pufrom. RNA, vezana na membransko vezane proteine, smo vizualizirali z avtoradiografijo in kvantificirali. Signal negativne kontrole (vzorec s proteinom BAP) je bil odvzet od signala iz vzorcev s pokrovčkom MTases. Analize so bile izvedene v treh izvodih. Prikazani so relativna aktivnost / vezava v primerjavi z encimom divjega tipa (nastavljeno na 100%) in sd vrednosti.

Slika v polni velikosti

Nato smo uporabili analogen pristop za študije CMTr2. Izbrali smo 10 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo bodisi na ohranjenem delu aktivnega mesta (skupnega CMTr1 in CMTr2) bodisi neposredno zunaj njega (slika 2b). K74 v CMTr2, ki ustreza K203 v CMTr1, tvori dno mesta, ki veže kapico, in L77 naj bi predvidoma tvorila stran mesta, ki veže kapico. Nadaljnji izbrani ostanki so vključevali W85 (ki deluje z L77 in 5-5 'fosfatnim veznikom), T89 (ki veže 5'-5 'fosfatni veznik), K307 (ki deluje s hrbtenico RNA), H142 in E145 (ki so v motivu vezave na SAM) in S78, H86 in Q113 (ki se nahajajo blizu mesta, ki veže RNA, vendar ne tvorijo nobenih posebnih interakcij). Ti ostanki so bili posamično substituirani z alaninom. Kot je prikazano na sliki 5, substitucije vsakega od izbranih ostankov CMTr2 vplivajo na vezavo RNA. Na katalitično aktivnost CMTr2 manj vplivajo substitucije, vendar zmanjšanje aktivnosti korelira z zmanjšanjem vezave substrata. V skladu z modelom alaninske substitucije K74A, L77A, W85A, T89A, K307A, H142A in E145A močno vplivajo tako na vezavo RNA kot na katalitično aktivnost encima. Dejstvo, da je vezava RNA skoraj odpravljena z nadomeščanjem ostankov, za katere se predvideva, da so pomembni za vezavo SAM, vendar niso v neposrednem stiku z RNA, kaže, da je vezava kofaktorja s CMTr2 bistvenega pomena za vezavo RNA. Nadomestki ostankov S78, H86 in Q113 le blago vplivajo na vezavo RNA in katalizacijo, zato niso bistveni za aktivnost CMTr2 MTase. Za zaključek so dobljeni rezultati za substituirane proteine ​​potrdili natančnost homolognega modela CMTr2 in potrdili ostanke, ki so vključeni v vezavo substrata.

Diskusija

Do danes so bile strukturne informacije na voljo samo za virusne 2'- O -ribozne mRNA MTaze iz poxvirusov in flavivirusov. Naša struktura človeške katalitične domene CMTr1 je prvi primer strukture, določene za celični encim te vrste. To je tudi samo drugi encim te skupine (drugi je virus vakcinije z beljakovinami VP39; banka za beljakovinske podatke (PDB) ID: 1AV6 (ref. 13)), za katerega je na voljo struktura z vezanim substratom oligoribonukleotida.

Dva najbolj ohranjena elementa celičnih, poksvirusnih in flavivirusnih encimov sta žep za vezavo SAM, ki določa položaj dajalca metilne skupine, in aktivno mesto, ki določa položaj ciljnega nukleozida 13, 14, 23 . Presenetljivo pa je, da celični in virusni encimi na ganozinski pokrovčki medsebojno delujejo na zelo različne načine, čeprav se mesto, ki veže pokrovko, nahaja na istem območju njihovih struktur (slika 6b). V virusu vakcinije virusa VP39 (na primer PDB ID: 1AV6 (ref. Ref. 13)) je gvanozin skoraj v celoti zakopan v globok žep, vnet med dve aromatični verigi (Y22 in F180) in usmerjen s Hoogsteenovim robom proti dnu zavezujočega žepa (Slika 6c). VP39 torej zazna prisotnost metilne skupine m 7 G 13, 24 . V strukturah flavivirusnih MTaz, vezanih na analogni pokrovček (na primer PDB ID: 2P40 (ref. 14) in 3EMB 15 ), se ostanek m 7 G zloži z enim aromatičnim ostankom (F24), vendar je mesto vezave odprto za topilo in interakcije med metilno skupino in beljakovinami so omejene. V strukturi človeškega CMTr1, določenem v tej študiji in v teoretičnem modelu CMTr2, je m 7 G vezan v globok žep, vendar je sladkorni rob nukleozidnih ostankov usmerjen proti žepu dna, pri čemer je metilna skupina izpostavljena in je vključen v nekaj interakcij z beljakovinami (slika 6d). Dejansko aktivnost CMTr1 ni odvisna od metilacije kapano gvanozina 16, 17, 25 . Te razlike med človeškimi in virusnimi encimi so pomembne, ker zagotavljajo osnovo za razvoj analogov pokrovčkov, ki lahko blokirajo MTaze virusnih kapic, ne da bi zavirali človeške encime. Ribozne MTaze, ki delujejo na pokrovčku, se zelo razlikujejo in popolno razumevanje evolucijskih prehodov med različnimi načini vezave bo zahtevalo določitev dodatnih struktur za druge encime iz te družine 17, 26 .

Image

( a ) Nadgradnja CMTr1 126–550 substratnega kompleksa (oranžna) na VP39 (PDB ID: 1AV6). (siva) v kompleksu z omejenim oligoribonukleotidom (modra) in SAH (vijolična). Strukture so bile nameščene s pomočjo C-α atomov iz osrednjega β-lista. ( b ) Pogled od blizu od žepa, ki veže m 7 G. Pri CMTr1 126–550 je beljakovina obarvana oranžno, m 7 G pa rumeno. Za VP39 je protein obarvan sivo, m 7 G pa je obarvan modro. ( c, d ) Pogled od blizu na interakcije v m 7 G vezavi v VP39 MTase ( c ) in CMTr1 126–550 ( d ).

Slika v polni velikosti

Skupni element človeških beljakovinskih in flavivirusnih encimov je pozitivno nabit grozd arginina (tvorjen z R218, R235 in R436 v CMTr1), ki stabilizira trifosfatni most in fosfatno hrbtenico ostankov RNA 1 in 2 (ref. 23, 27, 28). Čeprav je jedro katalitične domene človeških in cepivskih encimov zelo podobno (slika 6a), je vidna razlika med obema strukturama v tem, da v slednji manjka grozd arginina. Pravzaprav hrbtenica zasuka omejene molekule oligoribonukleotida tvori zelo malo interakcij v kompleksu cepiva MTase-RNA cepiva.

Za zaključek predstavljamo prvo strukturno karakterizacijo MTases celičnih cap1 in cap2, kar razkriva nov način prepoznavanja pokrovčkov RNA. Opisujemo tudi podobnosti in razlike z virusnimi encimi, s čimer zagotovimo okvir za zasnovo zaviralcev, ki temeljijo na strukturi, za obetavne tarče zdravil.

Metode

Evkariontska prekomerna ekspresija rekombinantnih beljakovin

Proteini CMTr1, CMTr2 in bakterijska alkalna fosfataza (BAP) so bili prekomerno ekspresionirani v celicah HEK 293 (ATCC) z uporabo p3xFLAG-CMV-10 plazmida z vstavljenim odprtim bralnim okvirom CMTR1 (znan tudi kot KIAA0082 , ISG95 , FTSJD2 in HMTR1 ), CMTR2 ( znana tudi kot AFT , FLJ11171 , FTSJD1 in HMTR2 ) ali BAP in reaktivni transfekcijski reaktor jetPEI (Polyplus Transfection) 17 . Za rekombinantno čiščenje beljakovin celice resuspendiramo v pufru za lizo (50 mM Tris-HCl (pH 7, 4), 150 mM NaCl, 1 mM etilendiamtetraocetna kislina (EDTA), 0, 5% Triton X-100, koktajl z zaviralci proteaze za uporabo s celicami sesalcev in ekstrakti tkiva (Sigma)) in po 1 uri inkubacije 30 minut centrifugiramo pri 20 000 g . Supernatant inkubiramo z 25 μl afinitetnega gela ANTI-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) z vrtenjem čez noč pri 4 ° C. Kroglice so bile oprane po priporočilih proizvajalca in resuspendirane v puferju za preverjanje aktivnosti. Vzorci proteinov so bili izvedeni v elektroforezi natrijevega dodecil sulfat-poliakrilamidnega gela za merjenje koncentracije CMTr1 in BAP v vsakem pripravku z denzitometrijo z uporabo ImageQuantTL programske opreme (GE Healthcare). Za CMTr2 je bila količina dobljenih beljakovin nezadostna za meritve denzitometrije; zato so relativne količine variant CMTr2 pregledali z Western blotom z uporabo monoklonskega protitelesa FLAG M2, proizvedenega pri miših (razredčitev 1: 5.000; Sigma-Aldrich) in antisišji IgGIRDye 800CW (razredčitev 1: 10.000; LI-COR Biosciences) in analizirali s programsko opremo Image Studio (LI-COR Biosciences).

Različice CMTR1 in CMTR2 so bile konstruirane z uporabo verižne reakcije polimeraze (PCR). Posamezne aminokislinske substitucije so bile uvedene z lokacijsko usmerjeno mutagenezo. Konstrukcije DNA za ekspresijo različic delecije, ki so vsebovale N-končne dele proteinov, smo pripravili z vstavitvijo stop-kodona za ostankom 550 za CMTr1 in po ostanku 430 za CMTr2. Izražanje C-terminalnih domen je bilo izvedeno s pomočjo konstrukcij, v katerih so bili odstranjeni regiji, ki sta kodirali ostanke 2–499 za CMTr1 in 2–429 za CMTr2. Mutirani geni so bili sekvencirani in ugotovili so, da vsebujejo le želene spremembe. Zaporedja vseh primerjev, uporabljenih v tej študiji, so navedena v dodatni tabeli S1.

Kristalografija

Vse preskuse kristalizacije smo izvedli po metodi difuzijske pare pri 18 ° C z osnovno raztopino CMTrl 126–550 pri koncentraciji 8–9 mg ml -1 v pufru, ki je vseboval 100 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl ( pH 8, 5), 10% glicerola, 0, 5 mM EDTA in 3 mM ditiotreitola (DTT). Pred kristalizacijo je bil protein razredčen z vodo do 4 mg ml -1 in pomešan z raztopino v vodnjaku v razmerju 1: 1 v / v.

Kristali nevezanega CMTr1 126–550 so bili dobljeni s sokristalizacijo proteina z m 7 GpppG in SAM s končno koncentracijo 0, 2 mM za oba liganda. Prvotni pogoj za kristalizacijo nevezanega CMTr1 126–550 je bil opredeljen na zaslonu za kristalizacijo indeksa (Hampton Research) in je vseboval 35% taksimata (pH 7, 0). Podatki difrakcije rentgenskih žarkov so bili zbrani na liniji 14.1 BESSY II na CCD detektorju Mar225 pri 100 K. Protein SeMet je bil kristaliziran z m 7 GpppG in SAM z obema ligandom v koncentraciji 0, 42 mM. Podatki o difrakciji kristalov SeMet so bili zbrani pri ločljivosti 2, 9 A. Strukturo smo rešili z uporabo eno-valovne anomalične difrakcije 29 v modulu 30 Phenix AutoSol s privzetimi parametri. Mesto selena je bilo ugotovljeno s HYSS, eksperimentalne faze so bile izračunane v fazi 31 in spreminjanje gostote s sploščenjem topila je bilo izvedeno z raztopino. Število zaslug po faziranju (pred modifikacijo topila) je bilo 0, 4, dobljeni preskusni zemljevidi gostote elektronov pa so bili dobro opredeljeni, kar je omogočilo sledenje modela, ki je bil sestavljen iz ostankov 141–544 proteina. Model je bil nato izpopolnjen glede na izvorne podatke, nastavljene na 2, 35 Å ločljivosti. Čeprav sta bila v kristalizacijski mešanici prisotna m 7 GpppG in SAM, njihove gostote elektronov niso opazili. To strukturo imenujemo „nezavezano“ (struktura (i)).

Različne kristalne oblike kompleksa CMTr1 126–550 z m 7 GpppG in darovalcem metilne skupine so bile pridobljene s povečanjem koncentracij liganda v zmesi za kristalizacijo na 0, 85 oziroma 1, 71 mM. Gojili so ga v dodatku 30% PEG 3350, 100 mM Bis-Tris (pH 6, 5) in 100 mM NaBr kot dodatek. Strukturo smo rešili z molekularno nadomestitvijo z uporabo Phaserja s predhodno pridobljeno nezavezano strukturo kot iskalnim modelom in jo prečistili do ločljivosti 1, 9 Å (struktura (ii); tabela 1).

Kristali kompleksa CMTr1 126–550 z m 7 GpppGAUC in SAM so bili dobljeni kot rezultat so-kristalizacije proteina z obema ligandom v koncentraciji 0, 85 oziroma 1, 71 mM. Kristale smo gojili v 30% PEG 3350, 100 mM Bis-Tris (pH 6, 5) in 100 mM NaBr kot dodatek. Strukturo smo rešili z molekularno nadomestitvijo z uporabo Phaserja s strukturo kompleksa CMTr1 126–550 z m 7 GpppG in SAM kot iskalnim modelom in izpopolnili do ločljivosti 2, 7 Å (struktura (iii); tabela 1). Asimetrična enota vsebuje dve kopiji proteinskega kompleksa. V enem izvodu opazimo gostoto elektronov za omejeni oligoribonukleotid in tri prepisane nukleotide. V drugi kopiji so vidni vsi štirje nukleotidi (dopolnilna slika S2b).

Vsi nabori podatkov so bili obdelani z uporabo XDS 32 z XDSAPP GUI 33 . Izdelava modela je bila izvedena v Coot 34, strukture pa so bile izpopolnjene z uporabo fenix.refine. Naslednji odstotki ostankov so bili v dovoljenem območju ploskve Ramachandran: struktura (i) −98, 7%, struktura (ii) −99, 8% in struktura (iii) −99, 6%. Simulirani izpustni zemljevidi za žarjenje so bili izračunani z uporabo Phenixa, Pymol pa je bil uporabljen za strukturne analize in pripravo strukturnih podatkov (//www.pymol.org; dostopano 1. avgusta 2013).

Priprava RNA substrata

RNA-GG (63 nukleotidni [nt] RNA oligonukleotid: 5′-GGGTAACGCTATTATTACAAAGCTCTTTTTGTAGTGTGTGCGTACCACGGTAGCAGGTACTGCG-3 ′) je bil proizveden z in vitro prepisovanjem s pomočjo Ampclcnc transkripcije s pomočjo AmpliSepcripta AmpliScrip.

Reakcije omejevanja so bile izvedene v skladu s priporočili proizvajalca z dodatkom 10 mCi [α- 32 P] GTP (3.000 Ci mmol -1 ; Hartman Analytic GmbH). Neoznačeni substrati so bili pripravljeni po analognem postopku z uporabo 1 mM gvanozin trifosfata namesto njegovega označenega dela.

Sintezo m 7 GpppGpApUpC smo izvedli s spajanjem 5'-fosforiliranega tetranukleotida pGpApUpC (0, 5 mg, amonijeva sol; TriLink Biotechnologies) s 7-metilguanozin 5'-difosfat imidazolidom (2, 7 mg, pripravljen kot je opisano prej 35 ) v 0, 2 ml vodni 0, 2 M N- etilmorfolinski / HCl pufer (pH 7, 0), ki je vseboval MnS04 · H20 (6, 4 mg) pri sobni temperaturi 24 ur. Nastalo zmes smo podvrgli pripravljalnemu čiščenju tekočinske kromatografije z visoko zmogljivo tekočino na aparatu Agilent Technologies 1200, ki je bil opremljen s kolono povratne faze Supelcosil LC-18-T (4, 6 × 250 mm) z uporabo linearnega gradienta metanola kot mobilne faze od 0 do 20% (v / v) v 0, 05 M amonijevega acetata (pH 5, 9) v 15 minutah s pretokom 1 ml min -1 . Odkrivanje ultravijolične svetlobe je bilo izvedeno pri 260 nm. Zadrževalni časi so bili 10, 1 in 10, 4 min za izdelek in substrat. Zbrani so bili ustrezni eluati iz 10 visokozmogljivih tekočinskih kromatografij in liofilizirani, da smo dobili produkt (0, 15 mg amonijeve soli). Predvidena molekulska masa za obliko proste kisline je 1.742, 0, izmerjena masa pa z masno spektrometrijo z visoko ločljivostjo (ionizacija z elektrosprejem) 1, 741, 3. Pokazalo se je, da je sintetizirani tetraribonukleotid substrat za CMTr1 MTase (dopolnilna slika S6).

Test metiltransferaze

Reakcije metilacije s CMTr1 smo izvedli v 30 mM Tris-HCl (pH 8, 4), 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 mM SAM, 10 U Ribolock z 10 pmol očiščenega encima in 0, 25 pmol substrata RNA v skupni prostornini 20 μl. Reakcijski pufer za CMTr2 se je razlikoval v pH (7, 4) in koncentraciji KCl (50 mM). Reakcije smo izvajali 1 uro pri 37 ° C. Za negativni nadzor smo uporabili beljakovine BAP. Modificirano RNK smo očistili z ekstrakcijo fenol / kloroform in oborino z etanolom. RNK smo prebavili bodisi z nukleazo P1 (Sigma-Aldrich) bodisi z RNase T2 (MoBiTec GmbH). Produkte prebave smo raztopili na 21% poliakrilamidnem / 8 M sečninskem gelu in vizualizirali z avtoradiografijo (Typhoon Trio, GE Healthcare). Kvantitativna analiza je bila izvedena s programsko opremo ImageQuant (GE Healthcare).

Vezavni test

Vezavne reakcije s CMTr1 smo izvedli v vezalnem puferju (30 mM Tris-HCl (pH 8, 4), 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 μg ml -1 govejega serumskega albumina in 10 U Ribolock) s 100 µM SAH, 5 pmol prečiščenega encima, 50 fmol 32 P-označene substrata RNA in 5 pmol neoznačene RNA brez strukture pokrova (konkurenčna RNA) v skupni prostornini 20 μl. Reakcijski pufer za CMTr2 se je razlikoval glede na pH (7, 4) in koncentracijo KCl (50 mM). Za negativni nadzor smo uporabili beljakovine BAP. Reakcije smo izvajali 30 minut pri 37 ° C in filtrirali skozi 0, 2 µm nitrocelulozno membrano (GE Healthcare) z uporabo Dot-Blot aparata (Bio-Rad). Vsako jamico smo sprali s 400 μl vezivnega pufra. Posušene membrane so bile izpostavljene PhosphorImager zaslonu, vizualizirane z avtoradiografijo in količinsko opredeljene s programsko opremo ImageQuant.

Napovedovanje in analiza strukture proteinov in RNK

Napoved strukture proteinov, vključno z identifikacijo strukturiranih domen in neurejenih regij, napoved sekundarnih struktur in uskladitev z beljakovinami znanih struktur, je bila izvedena prek spletnega strežnika GeneSilico 36 . Homološko modeliranje strukture katalitične domene CMTr2 je bilo izvedeno z uporabo pošasti FRankensteinovega pošastja 37, v kateri je bil ustvarjen niz začetnih modelov, ki temeljijo na alternativnih poravnavah ciljne predloge, in končni hibridni model je bil zgrajen s spajanjem potencialno najbolje zloženih fragmentov. Za primerjalno modeliranje ohranjenega jedra (ostanki 71–405 CMTr2) je bil uporabljen Modeller 38 9v7. Struktura končnih regij katalitične domene CMTr2 brez jasnega ujema s predlogo CMTr1 (ostanki 1–70 in 406–423 CMTr2) je bila predvidena z novo nagibanjem na predhodno izračunani model homologije jedra z omejitvami na sekundarni strukturi uporaba REFINER 39 . Kakovost tridimenzionalnih modelov proteinov v celotnem procesu modeliranja je bil ocenjen s programom MetaMQAP 22, ki napoveduje globalno natančnost strukturnega modela beljakovin in odstopanja posameznih ostankov od položajev njihovih kolegov v resnični (neznani) strukturi. Primerjalno modeliranje RNK smo izvedli z uporabo ModeRNA 40, čemur je sledila optimizacija lokalne geometrije in proteinov-RNA stikov z različico Bio + v silovitem polju CHARMM z uporabo Hyperchem 8.0 (Hypercube). Preslikavo elektrostatičnega potenciala na proteinskih površinah smo izvedli s Adaptive Poisson-Boltzmann Solver 41 . Preslikava ohranitve zaporedja na strukturo katalitične domene CMTr1 in CMTr2 je bila izvedena s pomočjo strežnika ConSurf 42 z nadomestno matriko JTT in Bayesovim modelom za določitev stopnje za ustrezne več poravnav zaporedja, pridobljenih prej 17 . Večplastna poravnava zaporedja in model strukture katalitične domene CMTr2 sta bila uporabljena tudi za načrtovanje eksperimentov mutageneze, usmerjene na mesto. Iskanje baze podatkov v strukturi je bilo izvedeno z DALI.

Bakterijska prekomerna ekspresija in čiščenje beljakovin

Sintetični gen CMTR1 je bil kupljen od imaGenes GmbH (IMAGE ID 4944457) in ga amplificiral s PCR z uporabo prajmov, ki so uvedli restriktivna mesta NcoI in XhoI, ki so združljiva s kraji kloniranja ekspresorskega vektorja pETMM41. Po vstavitvi v pETMM41 je gen CMTR1 na 5 'koncu obrobil z zaporedjem, ki je kodiralo HisTag in MBP. Slednji je bil ločen od gena CMTR1 z zaporedjem, ki je kodiralo mesto cepitve proteaznega virusa tobačnega jedka. Protein CMTr1 v celotni dolžini, izražen v E. coli je bil netopen. Za beljakovine, izražene v celicah 293 človeških embrionalnih ledvic, nismo mogli dobiti zadostne količine materiala za kristalizacijo; zato smo se odločili, da bomo delali z izolirano domeno RFM, za katero je bilo predvideno, da bo aktivna na podlagi analognih poskusov s tripanosomskim homologom 43 . Za določitev njegovih meja je bilo zasnovanih več variant brisanja z N- in C-terminalov, konstrukcije, ki temeljijo na ekspresijskem vektorju pETMM41, pa so bile pripravljene z uporabo kompleta QuikChange (Stratagene) ali PCR navznoter. V ArcticExpress (DE3) E so bile prekomerno izražene proteinske variante. sev coli in očistili na nikelj napolnjeno smolo (QIAGEN), aktivnost raztopljivih variant okrnitve pa smo preizkusili v testu MTase (glejte spodaj). Najprej smo izbrali varianto beljakovin s črtanjem ostankov 551–835 na C-terminalu (CMTr1 1–550 ). Izraženo je bilo v E. coli v topni obliki, vendar je bil nagnjen k razgradnji. Nato smo uporabili CMTr1 1–550 v poskusih z omejeno proteolizo, ki so pokazali, da je bila oblika proteina, ki je bila najbolj stabilna pri prebavi tripsina in kimotripsina, enaka velikosti kot produkt spontane razgradnje. Po naših napovedih s programom MetaDisorder 44 je N-terminus CMTr1 bogat z intrinzično motnjo, ki bi lahko postala dovzetna za spontano proteolitično razgradnjo. Sekvenciranje N-terminalov je pokazalo, da ni bilo 125 ostankov N-terminalov. V ArcticExpress (DE3) E je bila pripravljena in prekomerno izražena črta za črtanje CMTr1 126–550 kot prekomerno izražena kot fuzijski protein z MBP. sev coli (Stratagene). Ekspresijo CMTr1 126–550 -MBP induciramo z 0, 3 mM IPTG pri optični gostoti 0, 8 in celice nadalje gojimo 24 ur pri 12 ° C. Nato so jih lizirali v pufru, ki je vseboval 100 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 10% glicerol, 10 mM β-merkaptoetanol (2-ME), 5 mM imidazola, 1 mg ml -1- lizocima in zmes zaviralcev proteaze. Po 30 min smo koncentracijo NaCl povečali na 500 mM. Lizat se sonicira, centrifugira in razjasni s filtracijo. Očiščeni lizat smo nato naložili na 5 ml HisTrap Crude kolono (GE Healthcare), ki je bila prej uravnotežena s 5 mM imidazola, 500 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 10% glicerola in 10 mM 2-ME. CMTr1 126–550 -MBP smo eluirali v gradientu imidazola 40–80 mM. Izbrane frakcije smo čez noč dializirali v pufer, ki je vseboval 30 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 10% glicerol, 0, 5 mM EDTA in 3 mM DTT. Po tem koraku smo dializirani vzorec naložili v stolpec MonoQ (GE Healthcare), ki je bil prej uravnotežen z dializnim pufrom. Beljakovine smo eluirali v 250–280 mM NaCl gradientu in preko noči prebavili pri 4 ° C z uporabo proteaze tobačnega jedka. Prebavljen vzorec smo naložili na 5 ml HisTrap Crude kolono, uravnoteženo z 250-280 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 10% glicerol, 0, 5 mM EDTA in 3 mM DTT. Flukcija skozi pretok se koncentrira in očisti na gel filtracijski koloni Superdex 75 10 / 300GL (GE Healthcare). Izbrane frakcije, ki vsebujejo CMTrl 126–550, smo koncentrirali na 8, 5 mg ml -1 in shranili pri 4 ° C v pufru, ki je vseboval 100 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8, 5), 10% glicerola, 0, 5 mM EDTA in 3 mM DTT. Derivat SeMet proteina je bil izražen v minimalnem mediju, dopolnjenem s SeMetom in očiščen po istem protokolu.

Analiza metilacije in vitro z uporabo 3H-metil-SAM

Reakcije metilacije s CMTr1 smo izvedli v reakcijskem puferju (30 mM Tris-HCl (pH 8, 4), 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT in 10 U Ribolock), ki je vseboval 1 μCi [3H-metil] -SAM, 50 pmolov substrata in očiščenega encima v skupni prostornini 20 μl. Reakcijski pufer za CMTr2 se je razlikoval glede na pH (7, 4) in koncentracijo KCl (50 mM). Za CMTr2 je bil namesto cap0 RNA uporabljen substrat cap01-RNA. Po 90-minutni inkubaciji pri 37 ° C smo encim 10 minut toplotno denaturirali pri 75 ° C. Vzorci so bili nato naloženi na papir DE 81 DEAE (Whatmann). Prosti [3H metil] SAM smo odstranili s spiranjem membrane s 50 mM fosfatnim pufrom (pH 7, 0). Posušene membrane smo prenesli v scintilacijske viale z 1 ml tekočega scintilatornega koktajla (Rotiszint eco plus, Roth). Količino vgradnje 3 H-metilne skupine v substrate, vezane na membrano, smo izmerili s pomočjo tekočega scintilacijskega analizatorja Tri-Carb 2900 TR (Packard Bioscience; Dodatne slike S5, S6).

Dodatne informacije

Pristopne kode : Atomske koordinate in strukturni faktorji kristalografskih struktur CMTr1 so bili shranjeni v Protein Data Bank s pristopnimi kodami 4N48 (kompleks z m 7 GpppGAUC), 4N49 (kompleks z m 7 GpppG) in 4N4A (nezavezan protein). Atomske koordinate strukture modela CMTr2 so na voljo v: //www.genesilico.pl/iamb/models/RNA.MTases/CMTr2/ in iz //www.figshare.com/articles/Structure_of_CMTr2_in_complex_with_capped_mRNA_theoretical_model/8405

Kako citirati ta članek : Smietanski, M. et al. Strukturna analiza človekovih 2'- O -riboza metiltransferaz, ki sodelujejo pri tvorbi pokrovčkov mRNA. Nat. Komun. 5: 3004 doi: 10.1038 / ncomms4004 (2014).

Pridružitve

GenBank / EMBL / DDBJ

  • 4N48
  • 4N49
  • 4N4A

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dopolnilne slike S1-S6 in dopolnilna tabela S1

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.