Stenoza sproži širjenje spiralnih biofilmov pseudomonas v valjastih sistemih pretoka | znanstvena poročila

Stenoza sproži širjenje spiralnih biofilmov pseudomonas v valjastih sistemih pretoka | znanstvena poročila

Anonim

Predmeti

  • Biofilmi
  • Biomedicinski materiali

Izvleček

Biofilmi so večcelične bakterijske strukture, ki se držijo površin in pogosto obdarujejo populacijo bakterij s toleranco na antibiotike in druge okoljske žalitve. Biofilmi pogosto kolonizirajo cev medicinskih pripomočkov s slabo razumljivimi mehanizmi. Tu smo preučevali helikoidno širjenje biofilmov Pseudomonas putida skozi cilindrične kanale različnih premerov v počasnih režimih laminarnega pretoka. Numerične simulacije takšnih tokov razkrivajo vrtinčno gibanje v stenozah in stičiščih, kar poveča adhezijo bakterij in pospeši tvorbo nitastih struktur. Eksperimentalno je bilo ugotovljeno tvorjenje dolgih, nizvodno tekočih bakterijskih niti, ki izvirajo iz zožitev in povezav, kot je napovedal naš model. Zaradi kopičenja bakterijske biomase nastane nitke v spiralni nestabilnosti. Ti vžigalniki se nato strdijo, dokler jih stene cevi ne omejijo, in se razširijo po celotni dolžini cevi, ne da bi ovirali pretok. Tridimenzionalni diskretni model filamentov podpira ta mehanizem strjevanja in omogoča simulacije dinamike vijačnic v skladu z našimi eksperimentalnimi opazovanji. Te ugotovitve opisujejo nepričakovani mehanizem za širjenje bakterij v cevnih omrežjih, ki bi lahko sodelovali pri nekaterih bolnišničnih okužbah in bakterijski kontaminaciji kateterjev.

Uvod

Številne bakterijske vrste tvorijo biofilme, ki so večcelični sklopi, pritrjeni na površine in jih drži zunajcelični polimerni matriks 1, 2, 3 . Bakterije, ki živijo v biofilmu, postanejo izjemno tolerantne na antibiotike in razkužila 4, 5 . Biofilmi, ki jih najdemo na medicinski opremi, kot so katetri in drugi vsadki, so vzrok številnih bolnišničnih okužb, vključno z okužbami krvnega obtoka, sečil in protez 6, 7, 8 . V industrijskih okoljih biofilmi povzročajo veliko škode v tako raznovrstnih scenarijih, kot so zastrupitev s hrano, biofilni in prezračevalni sistemi 9, 10, 11, 12, zaradi česar je njihova prisotnost velik gospodarski in tehnični problem. Kljub temu biofilmi pomagajo tudi pri številnih biotehnoloških aplikacijah in čiščenju odpadnih vod 11, 13, 14 . Nekateri najbolj uničujoči učinki nastajanja biofilma so zapleti, ki jih prinaša vrsta Pseudomonas pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom po kolonizaciji katetrov in drugih medicinskih pripomočkov 15 . To ni omejeno na Pseudomonas aeruginosa , patogeno bakterijo, ki je lahko smrtna, kadar prizadene kritične organe 16, 17 . Opisane so tudi okužbe običajnega prebivalca tal in kolonizatorja rastlinskih korenin P. putida , povezane z uporabo nepravilno steriliziranih raztopin in vsaditve katetrov ali drenažnih cevi 18, 19, 20, 21, vključno s primeri sepse in bakteremije 22, 23, 24, 25 . Večina sevov P. putida (npr. Referenčni sev KT2440) nima genov, ki bi spodbudili virusnost 26, zaradi česar je njihovo ravnanje varnejše. V naših rokah nam je to omogočilo optimalen model za preučevanje nekaterih mehanskih in fizikalnih vidikov razvoja biofilma 27, 28 . S kombiniranjem numeričnih modelov z mokrim eksperimentiranjem smo pregledali širjenje biofilmov P. putida na notranjih površinah krožnih cevi, običajne oblike mnogih medicinskih pripomočkov, ki prodrejo v bolnikovo telo 29, 30 . V ta namen smo vzpostavili enostavno hidravlično ureditev cevnih cevi, ki je kombinirala različne premere in vrste stičišč, v katerih je kapljalni ali pulzilen tok premikal tekočino. Nato so celice P. putida injicirali na ločena mesta takšnih cevi in ​​postopek tvorbe biofilma pregledali na sklepih in spojnicah. Kot je prikazano spodaj, so se tvorile bakterijske nitke, ki so se razvile, da so se v natančno spiralnem vzorcu ovile okoli notranjih sten epruvete. Naši poskusi, skupaj s podporo v silikonskih simulacijah, kažejo, da je fizična nastavitev, ki jo prinašajo pulzalni tokovi, olajšala kolonizacijo cevi v sistemu. Ti podatki ne samo mehanično dokumentirajo in pojasnjujejo nastanek spiralnih biofilmov v cilindričnih hidravličnih sistemih, ampak tudi zahtevajo ponovno preučitev vrste hidravličnih tokov, sprejetih za dovajanje tekočine v medicinske pripomočke.

Rezultati

Vijačni biofilm se razvije v različnih ceveh

Sistem za pretok milifluidnega toka, ki je bil uporabljen za pregled razvoja biofilma v valjastih silikonskih ceveh, je skiciran na sliki 1a. Nastavitev je omogočila inokulacijo določenih števil celic P. putida na ločenih mestih, kot je razloženo v razdelku Materiali in metode. Prvo serijo poskusov smo izvedli z referenčnim sevom P. putida KT2440 in s hitrostjo pretoka 0, 15 - 0, 45 ml / min (povprečne linearne hitrosti od 0, 8 do 2, 3 mm / s za cevi s premerom 2 mm) pri sobni temperaturi za največ 10 dni. Reynoldsova številka (brezdimenzionalno število, ki izraža razmerje inercijske do viskoznih sil, opredeljeno kot Re = ρvD / μ, kjer ρ, v, μ predstavljajo gostoto tekočine, hitrost in viskoznost tekočine, medtem ko je D premer cevi), je torej v območju 1, 5 –4.7. Konstrukcije hidravličnih tokokrogov so bile prilagojene tako, da motijo ​​hidrodinamične pogoje pretoka v silikonskih ceveh (dopolnilna slika S1a-j). Za spreminjanje premera (notranji premer 1–2 mm) smo uporabili konektorje za razcepitev ali spajanje vodov, sponke za delno okluziranje cevi z deformiranjem cilindrične geometrije (slika 1b – d). Filomenti biofilma se sistematično pojavljajo mimo stenoz in kotov, ki jih povzročajo adapterji, spoji in spone.

Image

( a ) Skica poskusne postavitve. Odstopanja premera cevi: ( b ) adapter, ( c ) T-stikalo, ( d ) navpično usmerjena objemka. ( e ) Podrobnosti o valjčni črpalki ISMATEC IP-C 8, uporabljeni v poskusih. ( f ) Shema naprave, uporabljene za eksperiment s kapljičnim tokom.

Slika v polni velikosti

Opazili smo nastanek dolgih nitk iz biofilma, navitih na stenah v različnih delih cevne mreže (slika 2a, b). Vijačnica prilagodi svoj tok premeru cevi, z večjimi vrtiči za večje premere (dodatna slika S2). Helice so ponavadi zapolnile celotno dolžino cevi, v kateri so rasle, s skupno dolžino nekaj centimetrov ali decimetrov (dodatna slika S3). Popolnoma razvite vijačnice so se nahajale blizu sten cevi in ​​niso motile primarnega pretoka, kot prikazuje slika 3. Specifična lokalna geometrija (spone, stičišči, adapterji) in ukrivljenost lahko spremenijo možnosti pritrditve bakterij na površino, kar bo ustvarilo eno ali več semen biofilma; Posledično opazimo enojne (sl. 2a) ali večkratne (sl. 2b) spiralne niti.

Image

Razlike v lokalni geometriji ali ukrivljenosti spodbudijo nastanek ( a ) enojne vijačnice ali ( b ) vijakov, ki se prekrivajo. Fotografije so bile narejene po 4 dneh neprekinjenega pulzalnega črpanja, ustvarjenega z valjčno večportno črpalko s pretokom 0, 45 ml / min. Helice so vidne s prostim očesom. Svetlost in kontrast sta bila prilagojena za izboljšanje slik.

Slika v polni velikosti

Image

Popolnoma razvite vijačnice ležijo blizu sten cevi. Svetlost in kontrast sta bila prilagojena za izboljšanje slike.

Slika v polni velikosti

Te zvite strukture so krhke in majhna vznemirjenja, kot so vibracije ali zračni mehurčki, lahko uničijo vijačnico ali cepijo nit na niz obročev (slika 4). Ko se je pretok ustavil, se je struktura počasi sesedala in razpadla; če bi se pretok obnovil, so se vnovični vzorci ponovno pojavili. Razvijanje filamentov, pritrjenih samo na steno na določenih točkah; pospešeni dodatni film S1 prikazuje upočasnjeno gibanje vijačne nitke vzdolž objemke. Še vedno slike kažejo, da so te niti nastale kot rezultat dinamičnega procesa, ki je oblikoval naraščajočo biomaso v času in prostoru; strukture, zasukane s časom, vendar so bile tudi premikane navzdol, kar je povzročalo vznemirjenje vlake vzdolž cevi.

Image

Svetlost in kontrast sta bila prilagojena za izboljšanje slike.

Slika v polni velikosti

Vijačni vzorci izhajajo iz procesa elastične nestabilnosti

Razvoj spiralnih biofilmov, opaženih v naših poskusih, je spontani mehanski postopek, ki preoblikuje naraščajočo nit biofilma s presežno dolžino, omejeno v cev valjastega prereza in fiksne dolžine. Vijačni vzorec nastane kot naravno mehansko ravnovesje, ki minimizira elastično energijo niti 31, 32 . Omejitve, ki prepovedujejo ravnotežje z naravnimi nitmi, na primer prekomerna dolžina ali vir zasuka, dajejo prednost začetku in strjevanju spiralnih nestabilnosti. Ravni navoj določene dolžine, omejen v krajši cevi, se lahko razvije v helikoidno strukturo, če se uporabi primerno vznemirjenje 31, 33, 34 .

Za napovedovanje nekaterih značilnosti oblikovanja vijačnih vzorcev smo uporabili diskretni model filamentov 35 za preučevanje dinamike niti v teh geometrijah (glej Metode in dodatno besedilo). Slika 5 prikazuje tvorjenje in razvoj vijačnic, sliki 6 in S4 pa skupaj z dopolnilnima filmoma S2 in S3 prikazujeta računski opis in rezultate našega modela v kvalitativnem dogovoru s poskusi. Naključno motene niti (slika 5a, b) s povečano dolžino se razvijejo v drobne vijake (glej slike 5c, d in 6a). Povečanje dolžine se najprej porazdeli vzdolž celotne konstrukcije z upogibanjem niti iz ravnine, da nastane vijak, podoben vijaku vznemirjenja (vijačne zanke). Ta vznemirjenja med seboj tekmujejo za podaljšanje niti, kar vodi do nastanka večjih zank na račun drugih, ki izginejo (sl. 6b, analogno sliki 5e, f). Navoj se končno ovije okoli notranjih sten cevi, če dopušča njegova dolžina. Končna spiralna oblika je določena z dolžino navoja in polmerom cevi (slika 5g, h; dodatna slika S4). Ko je ovita okoli cevi, je naklon odvisen od polmera r cevi in presežne dolžine L vijačnice - L cevi, kjer je L cev dolžina cevi in ​​L vijačnica dolžina nitke, ovite okoli nje. Obstaja omejitev dolžine za ustvarjanje učinkovite vijačnice, naložena z velikostjo cevi. Navoj cevi dolžine L se ovije okoli cevi, ki tvori k korake nagiba L cevi / k, pod pogojem, da: L vijak 2 ~ L cev 2 + 4π 2 r cev 2 k 2 . Naše simulacije na sliki 6 in dopolnilni sliki S4 zagotavljajo končne vijačne vrtove velikosti 5 mm za 2 mm cev v območju opazovanih parcel. Na vmesne stopnje razvoja vijačnice vplivajo elastični parametri navoja, hitrost navoja niti kot tudi njegova dolžina in zasuk na katerem koli od robov navoja, ki se lahko počasi povečujejo, glejte Dodatno besedilo.

Image

( a – b ) Nukleirano ravno nit biofilma (zelene puščice) teče navzdol. ( c – d ) Vijačna nestabilnost upogne nit biofilma, da oblikuje začetni valoviti vzorec. ( e – f ) Kopičenje biomase in naknadna deformacija pospešujeta radialno širitev valovitega vzorca, kar ima za posledico zaporedje velikih upognjenih zank. ( g – h ) Polmer cevi preprečuje širitev vijačnic in nit oblikuje v končno spiralno obliko. Svetlost in kontrast sta bila prilagojena za izboljšanje slik.

Slika v polni velikosti

Image

Evolucija vijačnice, ki prikazuje: ( a ) pojav spiralne nestabilnosti in ( b ) strjevanje zaradi povečanja dolžine.

Slika v polni velikosti

Mehanske lastnosti biomase določajo razvoj vijačnega vzorca, kot kažejo naš model in poskusi (glej spodaj spodaj): biofilmi so raznovrstni materiali, sestavljeni iz kolonije bakterij, povezanih z vmesnikom, vdelanih v zunajcelični matriks; bakterije otrdijo matrico in spremenijo njen odziv 36 . Poleg tega so z eksperimentalnimi opazovanji biofilmi opredelili kot viskoelastične materiale 37, 38, 39, katerih mehanske lastnosti se dinamično spreminjajo kot odziv na celične procese in interakcijo z okoljem 40, 41 .

Opaženo je, da se v vijačnih vzorcih v različnih poskusih različno giblje vzdolž nukleiranih filamentov: tvorba spiralnih vzorcev ni bila le zožitev navzdol (navzgor, kot je razloženo zgoraj, glej sliko 7a, b, dopolnilo Fig. S5), pa tudi obvodno oviro (ko nitka, predhodno obarvana na mestu injiciranja, končno zadene površino, glej dopolnilno sliko S6a, b). V zadnjem primeru se nit iz biomase, ki teče navzdol po toku, upočasni, ko se vbrizga v posodo za odpadke in pade na površino, kar povzroči učinek zvijanja 42, 43, 44, 45, ki poveča spiralno nestabilnost na nitki. Tako naši poskusi kažejo, da sta tako rast biomase kot zvijanje niti v njenih skrajnih mejah dva vira vznemirjenja, ki spodbujata oblikovanje vijačnega vzorca v skladu z našimi teoretičnimi rezultati.

Image

Zamenjava ( a ) krožnih priključkov z ( b ) navpično usmerjenimi sponkami (glej sliko 1d) deformira simetrijo v prerezu cevi, zaradi česar se nukano nit naredi na dnu cevi in ​​sprejme asimetrično in nepravilno obliko. Svetlost in kontrast sta bila prilagojena za izboljšanje slik.

Slika v polni velikosti

Stenoze pospešujejo nukleacijo niti biofilma in spreminjajo njihovo evolucijo

Vijačni vzorci biofilma na slikah 2, 3, 4 in dopolnilni sliki S2 so se pojavili na izhodih s T-stičiščem (slika 1c) in v cepilnih ali združljivih vodih. Podobne vzorce smo opazili pri ravnih črtah, ki jih povezujejo adapterji premera ali spone (sl. 1b, d), pa tudi v ravnih netesnih ceveh (dodatna slika S6). Kaj povzroča nastanek filamentov? Začetni bakterijski inokulum povzroči prvotno pritrditev bakterij in naknadno tvorbo biofilma v bližini točk inokulacije. Bakterije se razmnožujejo znotraj biofilmov in proizvajajo zunajcelične polimerne snovi (EPS), zmes na osnovi polimera, ki je nastala iz zunajcelične DNK, beljakovin in polisaharidov. Del te snovi, pomešane s celicami (biomasa), se s strižno silo izloči in se prenaša navzdol po struji. Postopek končno spodbudi oblikovanje dolge niti, kot je prikazano na sliki 5a. Ta mehanizem spominja na mehanizem nukleiranja nitk biofilma v kotih 38, 47 . Še več, ker je bilo število Reynolds majhno (približno 1–4, vsaj 1000-krat manjše od začetka turbulentnega režima), je bil pretok laminaren in opazili smo, da so stenoze favorizirane točke v cevni mreži za okrepljen proces nukleacije. Za testiranje naše hipoteze smo izvedli numerično simulacijo, kjer smo rešili nestisljive Navier-Stokesove enačbe za vizualizacijo tokovnih tokov v epruvetah in stenozah, pri čemer smo uporabili iste parametre in geometrije, uporabljene v poskusih. Standardni reševalci končnih elementov so pokazali nastanek majhnih lokaliziranih vrtincev pri zožitvah (slika 8a, b) in stičiščih (slika 8c, d). Biomasa se na koncu ujame v vrtine 48, 49, 50 in jo odpelje do sten, kjer se oprime in ustvari dodatna semena biofilma 38 . Ta proces, ki se je nadaljeval v času, oblikuje semena biofilma v enega ali več filamentov, ki tečejo navzdol skozi osrednji del cevi (slika 5a, b). Rezultat števila nukleiranih spiralnih filamentov bo končno odvisen od posebne kombinacije parametrov, ki vplivajo na lokalno hidrodinamiko v točkah stenoze (velikost in oblika prereza cevi, ukrivljenost, dinamika pretoka).

Image

( a ) enakomeren pretok in ( b ) pulzni pretok v določenem času skozi cevni adapter. Velikost vrtinčaste regije v ( b) se sčasoma širi in krči. Barvne rezine kažejo smer x komponente hitrosti. ( c ) Racionalizacija in ( d ) y komponenta diagrama hitrosti tekočine znotraj T-priključka. Upoštevajte poleg vrtincev po stenozah tudi sekundarne vrtince, ki jih na vogalih tvorijo tokovi v ( c ).

Slika v polni velikosti

Geometrija stenoz vpliva tudi na poznejšo dinamiko tvorjenja vijačnic. To razmerje med obliko navoja vijačnic in učinkom geometrije stenoze je bilo potrjeno z zamenjavo krožnih spojnic (slika 7a) s sponkami (slika 7b), da se asimetrično deformira presek cevi. Nastala je vstavljena spiralna nitka (slika 7b), primerljiva s spiralo majhnega polmera in naklonom na sliki 5c. Objemke so pretrgale simetrijo in nitke biofilma so se ponavadi širile po dnu vodoravnih cevi (Dopolnilna slika S5a), kar je zavleklo nastanek vijačnic za 3 dni (od 7 do 10 dni s sevom P. putida KT2440). Poleg zagotavljanja mehanizmov za nukliranje biofilma lahko zožitve vplivajo na razvoj biofilma na dodatne načine. Že oblikovana ravna biofilmska nit, ki doseže stenozo, je napeta in spremenjena s hitrostnimi spremembami. To ustvari vlak vznemirjenja, ki se širi navzdol z nitjo in je ojačan z elastičnimi mehanizmi, ki se razvijejo v spiralno obliko, omejeno s stenami.

Dinamika tekočine in kopičenje biomase spreminjata čas nastanka vijačnic

Evolucija biofilmovih niti v tekočinah je bila opisana kot vzajemno delovanje med tekočino in elastično strukturo 46, 51, hipoteza, ki najbolje razloži naša opažanja. Zato smo raziskali, kakšna je bila vloga tekočine in narave biomase pri oblikovanju vijačnih vzorcev.

Za gibanje tekočine skozi cevi smo uporabili valjčno črpalko (slika 1e). Valjčne črpalke temeljijo na peristaltičnem mehanizmu, ki napne kanal, ki vsebuje tekočino, z valji, da sproži pulzilen prednji tok 52 . Spremembe frekvence vrtenja valjev povzročajo različne pretoke. Cev za priključitev črpalke je občasno lokalno stiskal valjček premera 1, 8 cm, da bi ustvaril majhne tekočinske pakete, prisiljene napredovati v smeri rotorja. Najprej smo preizkusili učinek pretoka na nastanek vijačnic. Ko smo povečali pretok v epruvetah notranjega premera 2 mm z 0, 15 ml / min (srednja hitrost tekočine 0, 8 mm / s) na 0, 45 ml / min (povprečna hitrost tekočine 2, 38 mm / s), smo opazili zmanjšanje časa tvorbe helikoidni vzorec za 2–3 dni z uporabo seva KT2440 (od 7 do 4–5 dni).

Poleg tega smo preučevali učinek dinamike pretoka na črpalki v spiralnem vzorcu, saj smo uporabljali peristaltično črpalko z definiranim pulzalnim tokom v dveh naloženih obdobjih ∼ 0, 1 in 0, 8 s, ki bi bile lahko v določenih pogojih povezane s helikoidnimi usmeritvami delcev 52, 53 . Izvedli smo teste za vizualizacijo pretoka s pomočjo injekcije črnila, da smo sledili toku, ko tečejo skozi zoženja in T-stičišča. V teh smo opazili majhne vrtince izven križišč, ki jim sledi tipičen laminarni Poiseuillov profil (glej Dopolnilni filmi S4 in S5 in slike S7), vendar brez helikoidnih usmeritev. Poleg tega je Deanovo število (De, brezdimenzionalno število, ki je produkt Reynoldsove številke in kvadratni koren razmerja premera cevi do ukrivljenosti) prenizko za razvoj stalnih spiralnih tokov (za naše tipične sklope je De <0, 1, približno 1000-krat manjši od začetka spiralnih pretokov) 54, 55 . Končno smo zasnovali en poskus s prilagajanjem postavitve, da nadomestimo pulzilen tok z enakomernim kapljičnim tokom (Sl. 1f; Dopolnilna slika S1c, d). Helices se je pojavil celo brez tega pulzalnega pretoka, kot je bilo pričakovati, da oblike nitk razvijejo elastične nestabilnosti, ko bo na voljo mehanizem pretoka za ustvarjanje semen biofilma. Zdi se, da pulzilen pretok olajša nastajanje semen biofilma zaradi večje recirkulacije mimo stenoz (slika 8b). Za določitev pomembnosti kopičenja biomase smo uporabili drugi sev P. putida mt-2, ki vsebuje katabolični plazmid pWW0, ki daje tudi sposobnost proizvodnje več biofilma 26, 56, 57 . V naši eksperimentalni nastavitvi (dopolnilna slika S1a, b; začetni OD 600 = 0, 2, pretok 0, 15 ml / min) so helikopterji P. putida mt-2 opazili po sedemurni inkubaciji, medtem ko je bilo za KT2440 potrebno 10 dni, kar kaže na to da je razpoložljivost biomase pomembna pri razvoju vijačnic.

V nadaljnjih poskusih smo zasnovali hidravlična vezja, da bi konkretno povečali ali zmanjšali količino razpoložljive biomase, ki jo tvori P. putida mt-2 v cevni mreži. V prejšnjem primeru (dopolnilna slika S1g, h) smo 500 ml ml Erlenmeyerjeve bučke povezali z nasičeno kulturo. V kasnejšem primeru (dodatna slika S1e, f) smo spremenili material cevi, da smo zmanjšali pritrditev bakterij na epruvete, tako da smo silikonske cevi zamenjali s PVC cevkami, kar je zaradi večje hidrofobnosti odložilo pritrditev nekaterih bakterijskih sevov. 58 . V prvem primeru so se vijaki pojavili čez 24 ur (namesto 3–4 dni), v drugem pa je bil spiralni vzorec popolnoma zatrt. Ti rezultati kažejo na močno povezavo med količino biomase, ki se je nabrala v epruvetah, in časovnim oknom, v katerem se oblikuje spiralni vzorec.

Diskusija

Opazovanje spiralnih biofilmov v pulznih in kapalnih tokovih določa nove možnosti za proučevanje mehanizmov širjenja biofilma. Zdi se, da so spiralni biofilmi rezultat pretočnih procesov, ki občasno pripeljejo celice in zunajtelesni material na stene cevi v kombinaciji z mehansko deformacijo, ki zvije nitke biomase, zaprte znotraj cevi. Ker v medicinski opremi, industrijskih sistemih in naravnem okolju prevladujejo razlike v premeru cevi, lahko pričakujemo, da so te vijačne strukture zelo razširjene. Eksperimentalno smo opazovali nastanek spiralnih nestabilnosti na dolgih nitih po strugah in spremljali strjevanje spiralnih nitk od začetka nestabilnosti do poznih stopenj, v katerih se ovijajo okoli notranjosti cevi. Helice nastanejo kot čisto fizičen rezultat, ki porazdeli odvečno dolžino v nitki bakterijsko ustvarjene biomase, kot ponazarjajo diskretni modeli filamentov. Ta študija povečuje naše znanje o sposobnosti bakterij, da se razmnožujejo v cevnih mrežah in predlaga nadaljnja dela, osredotočena na opis potencialnih posledic, ki jih ta pojav lahko povzroči, če se razvije v medicinski in industrijski opremi.

Metode

Bakterijski sevi in ​​pogoji rasti

Vsi sevi, uporabljeni v tej raziskavi, so bili fluorescentno označeni derivati P. putida , starševski sev P. putida mt-2 56 in TOL brez plazmidov P. putida KT2440 59 . Fluorescentni derivati ​​sevov so bili dobljeni z vstavitvijo, specifično za mesto, v kromosomskem intergeničnem območju miniTn 7- derivativ s konstitutivnim promotorjem, ki je sprožil ekspresijo GFP 60 . Bakterije so bile gojene čez noč v minimalnem mediju M9 61, dopolnjenem z 0, 2% (m / v) glukoze kot virov ogljika in 5 μg / ml gentamicina. Optična gostota kultur je bila nastavljena na OD 600, 0, 2 in 250 μl suspenzije je bilo vbrizgano v omrežje z 29G × 1/2 ″ - 0, 33 × 12 mm brizgo (Terumo). Točka inokulacije je bila približno nastavljena na sredini cevi (slika 1a). Bakterije so se lahko pritrdile na epruvete (45 min) in pretok se je sprožil pri 0, 15 ml / min. Ko je hidravlični krogotok imel eno črpalno cev, je bila končna hitrost pretoka 0, 15 ml / min; v primeru treh vodov je bil končni pretok 0, 45 ml / min (glej dodatno sliko S1).

Celotno mrežo smo sterilizirali z črpanjem 0, 2% (m / v) raztopine natrijevega hipoklorita pri 1, 6 ml / min v 1 uri, sprali s sterilizirano H20 in puferirali z M9 medijem kot zgoraj. Alternativno so bile polikarbonatne pretočne celice, povezane v omrežje (BioCentrum-DTU), uporabljene kot začetna mesta bakterijske inokulacije in pritrditve. Pretočne celice so bile prekrite s pokrovčkom 24 × 50 mm (Menzel-Glaser) in zatesnjene s silikonskim lepilom.

Nastavitev pretoka in slikanje

Pripravili smo več mrežnih arhitekturnih konfiguracij, da smo preučili vpliv spremenljivk na oblikovanje vijačnih vijačnic (dodatna slika S1a – j). Omrežje je vsebovalo 2-litrsko bučko Erlenmeyer, napolnjeno s svežim medijem M9, večnamensko valjčno črpalko, ki je sesala tekočino iz rezervoarja za hranila (ISMATEC IP-C 8), lovilnik mehurčkov in posodo za odpadke. Elementi vezja so bili spojeni s silikonskimi cevmi (VWR) s peroksidom, katerih notranji premer je 1 ali / ali 2 mm. Cevi so bile povezane z uporabo polipropilenskih T-spojev in adapterjev (EW-30623–66, 1/16 ″, Cole Parmer) z 0, 9 mm notranjim premerom. Po potrebi so bile uporabljene spone (vijačne spone VWR). Črpalka je bila v tokokrog povezana s cevmi notranjega premera mm 1, 60 mm (R3607, VWR). Slike so bile pridobljene z fotoaparatom Nikon D60 z objektivom AF-S Nikkor 18–55 mm. Nekatere eksperimentalne slike (navedene v napisih) so bile obdelane z Adobe Photoshop (Adobe Systems) za izboljšanje svetlosti in kontrasta s poudarjenimi vijaki znotraj cevi. Časovni posnetki so bili posneti z mikroskopom ScopeEye USB (NKS Tech Apps).

Diskreten model filamentov

Naš model opisuje dinamiko naraščajoče nitke biofilma, ki je izpostavljena delovanju elastičnih upogibnih in torzijskih sil. V nitkah je ena dimenzija (dolžina) veliko večja od druge (prečni prerez), kar vodi k opisu razvoja nitk z krivuljo (sredinska črta) z orientacijskim okvirjem { t, m 1, m 2 } (material okvir, slika 9a), ki zajema vrtenje prerezov materiala v vsaki točki vzdolž krivulje 62, 63 . Raztezanje in upogibanje sta predstavljena z deformacijo sredinske črte, zvijanje pa je ujeto z orientacijo materialnega okvirja. Kadar so deformacije majhne v primerjavi z značilno dolžino navoja, lahko napetosti, ki vplivajo na prerez, povprečimo in opišemo kot sila in moment, ki delujeta na srednjo črto. Medtem ko zanemarja deformacije prereza, ta pristop opisuje velike fizikalne in geometrijske lastnosti dolgih tankih nitk. Filament je predstavljen z zaporedjem segmentov e i = x i +1 - x i, ki povezujejo točke x i in materialnih okvirjev { t i , m 1 i , m 2 i } (slika 9b). t i je enota tangentnega vektorja na segment. Vektorji materialnih okvirjev so dobljeni z vrtenjem kota θ i glede na škofovski okvir { u i , v i }, referenčni okvir brez zasuka (glej sliko 9 in dodatno besedilo). Evolucija nitk je določena s spreminjanjem kotov θ i in položajev vozlišč x i .

Image

( a ) Nenehni opis in ( b ) diskretni opis. Škofov okvir { t, u, v } določa „počitek“ na kateri koli točki sredinske črte. Materialni okvir, ki označuje lokalno usmeritev { t (s), m 1 (s), m 2 (s)}, dobimo z vrtenjem { u (s), v (s)} kota θ okoli t ( s ). Osrednja črta je diskretizirana v niz točk { x 0, x 1,

.

, x n + 1 } in odseki e i = x i +1 - x i . Lokalni ortonormalen materialni okvir { t i , m 1 i , m 2 i } je dodeljen vsaki nastavitvi točke t i = e i / || e i ||, enota tangentnega vektorja na rob.

Slika v polni velikosti

Če predpostavimo, da je neizprosnost 46, je celotna energija diskretnega filamenta vsota energij upogibanja in zvijanja 35 :

Image

α in β sta upogibni in torzijski modul. Dejavnik

Image

je povezan z dolžino segmentov v neoblikovani konfiguraciji. Vektorji

Image

so materialne ukrivljenosti v deformirani in neformirani konfiguraciji. Okvir materiala se posodablja kvazistatično 35 . Z vsiljevanjem

Image

= 0 za vse odseke i, ki jih ni določil mejni pogoj, sledi sistem enačb za kote. Položaji točk se posodobijo z reševanjem enačb gibanja za srednjo črto 35 :

Image

Omejitev nerazširljivosti uveljavi metoda projekcijskega razdelilnika 64 . f predstavlja zunanje sile, ki delujejo na srednjo črto 65, 66, 67 . Modeliranje različnih mehanizmov, ki povzročajo povečanje dolžine z dodatnimi razteznimi izrazi v energiji, je zapletena naloga, ki lahko vodi do nepotrebno togo enačb. Namesto tega simulacijo procesa upogibanja in torzije zamenjamo s ponastavitvenimi koraki, pri katerih se dolžina med vozlišči ali številom vozlišč spreminja s fiksno hitrostjo. Več podrobnosti v dodatnem besedilu I.

Programska oprema

Za simulacije pretoka je bil uporabljen COMSOL Multiphysics. Model diskretnih filamentov je izveden z znanstveno programsko opremo MATLAB. Tridimenzionalna evolucija niti se vizualizira z jezikom navidezne resničnosti VRML 2.0.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

Videoposnetki

  1. 1.

    Dopolnilni video S1

  2. 2

    Dopolnilni video S2

  3. 3.

    Dopolnilni video S3

  4. 4.

    Dopolnilni video S4

  5. 5.

    Dopolnilni video S5

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.