Spremembe beljakovin v serumu v modelu kronične bolečine pri podganah kažejo na povezavo med živalmi in ljudmi | znanstvena poročila

Spremembe beljakovin v serumu v modelu kronične bolečine pri podganah kažejo na povezavo med živalmi in ljudmi | znanstvena poročila

Anonim

Predmeti

  • Biološke tehnike
  • Molekularna nevroznanost
  • Proteomska analiza

Izvleček

V prejšnjih delih smo pokazali prekomerno izražanje nekaterih beljakovin v bioloških tekočinah pri bolnikih, ki trpijo zaradi kronične bolečine. V tej proteomski študiji smo analizirali serum iz podgana modela nevropatske bolečine, pridobljene s kronično zožitvijo poškodbe išiasnega živca, v dveh časovnih presledkih, 2 in 5 tednov po žalitvi, da bi našli proteine, ki sodelujejo pri izražanju ali posredovanju bolečina. Podgane in CCI podgane so zdravili s fiziološko raztopino ali indometacinom. Dva tedna po ligaciji smo v podganah CCI ugotovili tri serumske beljakovine, ki so bile prekomerno izražene, od tega sta dva, alfa-1-makroglobulin in protein D, ki veže vitamin D, po 5 tednih po operaciji še povečana; v tem časovnem intervalu smo ugotovili povečano raven nadaljnjih beljakovin, in sicer apolipoproteina AI (APOA1), apolipoproteina E (APOE), prostaglandin-H2 D-izomeraze (PTGDS) in transtiretina (TTR), ki prekrivajo pretirano izražene beljakovine, ki jih najdemo pri ljudeh. Zdravljenje z indometacinom je odpravilo učinke ligacije. Analiza qPCR je pokazala, da so bili nivoji transkriptov APOA1, APOE, PTGDS in VDBP prekomerno izraženi v ledvenem delu hrbtenjače (izvor išiasnega živca), ne pa v striatumu (nepovezana možganska regija) podgan CCI, ki so jih zdravili s fiziološko raztopino 5 tednov po operacija, ki dokazuje, da je ledvena hrbtenjača možen vir teh beljakovin.

Uvod

Kronična bolečina (CP) nastane zaradi poškodb tkiva ali vnetja ali poškodb perifernih ali centralnih bolečinskih poti (nevropatska bolečina). Slednje je bolezensko stanje živčnega sistema, ki se lahko pojavi tudi v okoliščinah, v katerih ni očitnih poškodb ali vnetij (disfunkcionalna bolečina) 1 . Za CP je značilna preobčutljivost za bolečino, ki se kaže z bolečimi odzivi na običajno neboleče dražljaje (alodinijo) ali s povečano ali ekstremno občutljivostjo na bolečinske dražljaje (hiperalgezija), ki lahko trajajo dolgo po tem, ko se začetna poškodba razreši 2 . Vnosi nociceptorjev lahko aktivirajo dolgotrajno, a reverzibilno povečanje ekscitabilnosti in sinaptične učinkovitosti nevronov v osrednjih nociceptivnih poteh, dogodek, znan kot "centralna preobčutljivost", ki se kaže kot preobčutljivost na bolečino, taktilna alodinija, hiperalgezija na pritisk in povečana časovna vsota 3 . Trenutne možnosti zdravljenja CP imajo pogosto slabo delovanje in neželene stranske učinke, zato je treba nujno bolje razumeti molekularne mehanizme CP, da bi opredelili objektivne biomarkerje za izboljšanje diagnoze, terapije in razvoja zdravil za učinkovito zdravljenje bolečine 4 . V tem okviru se lahko proteomiki uporabijo za ustvarjanje beljakovinskih kart iz različnih vzorcev (vključno s telesnimi tekočinami in tkivi) in za korelacijo ravni ekspresije beljakovin s preučeno boleznijo 5 . Poleg tega so odkrivanje, oblikovanje in ocena novih zdravil močno odvisni od razjasnjevanja beljakovinskih mehanizmov, ki so vključeni v zadevno bolezen. Zlasti nevropatska bolečina odraža tako periferne kot centralne mehanizme preobčutljivosti, ki vključujejo transkripcijske in posttranskripcijske spremembe v senzoričnih živcih 6 . V zadnjem času so bile uporabljene študije metabolomike in proteomike iz naše in drugih skupin v poskusu prepoznavanja novih obetavnih biomarkerjev in procesov, povezanih s CP 7, 8, 9, 10, 11 in regeneracijo živcev 12 . Velik napredek pri razumevanju mehanizmov, na katerih temelji CP, je nastal na živalskih modelih bolečine, ki zagotavljajo koristne in temeljne sisteme za predklinične študije bolečine 13 . Razvita je bila serija približno 40 različnih živalskih modelov nevropatske bolečine, od katerih ima vsak različne značilnosti in mehanizme, da posnemajo specifična bolezenska stanja pri ljudeh, tako da povzročajo bolezni ali povzročijo travmatične poškodbe hrbtenjače ali perifernih živcev, ki vodijo v boleča stanja 14 . Eden najpogosteje uporabljenih modelov kronične nevropatske bolečine je enostranska poškodba išiasnega živca s kronično zožitvijo (CCI), ki sta jo na podganah razvila Bennet in Xie 15 . Sestavljen je iz štirih ohlapnih ligatur okoli išiasnega živca, ki se okluzijo, vendar ne zaustavijo epinevralnega pretoka krvi. Izvajanje je relativno enostavno in ustvarja robustno in stabilno preobčutljivost za bolečino vsaj en mesec po poškodbi. Ta model ima določeno stopnjo variabilnosti zaradi spola, starosti, prehrane in obremenitve, poleg kirurških spremenljivk, kot so tesnost zožitev in vrsta materiala za šivanje, ki se uporablja za ligacijo živca 16 . Kljub tem omejitvam so številne študije dokazale moč tega modela za razumevanje nevropatskih bolečinskih mehanizmov.

Nedavno so inovativno proteomsko analizo v zvezi z izražanjem proteinov v išiasnih živcih miši, ki so bili podvrženi CCI, opravili Vacca in sod . 17, 18, kar kaže, da kombinacija proteomskih metod z živalskimi modeli bolečine lahko pomaga prepoznati proteine, povezane z bolečino, ki lahko služijo kot diagnostični biomarkerji ali tarče zdravil in izboljša zdravljenje bolnikov s CP 19 . Na splošno je zaradi nepopolnosti sekvenciranja genomov za nekatere živalske vrste analiza proteomov pri večini živali še vedno v zgodnjih fazah v primerjavi z že dobro preslikanimi človeškimi proteomi. Vendar pa obstajajo različne metode za premagovanje te pomanjkljivosti, zlasti za manj značilne vrste, na primer iskanje homologije in človeško pripisovanje primarnih podatkov, ki jih išče BLAST20. Vendar to ni miš za podgane in podgane, saj je bil njihov genom popolnoma sekvenciran, kar kaže na visoko homolognost s človeško.

Cilj te študije je bil s proteomskim pristopom analizirati vzorce seruma iz modela nevropatske bolečine pri podganah, ki jih je prejel CCI sestričnega živca 15, v dveh časovnih intervalih, 2 in 5 tednov po žalitvi. Medtem ko ta dva intervala po poškodbi kažeta podobne znake nevropatske bolečine 21, se izrazito razlikujeta glede degenerativnih / regenerativnih procesov sestričnega živca 22 . Dejansko podgane in CCI podgane so zdravili z indometacinom med 2 in 5 tedni po operaciji, saj je močno zdravilo 23 in eno najpogosteje uporabljenih nesteroidnih protivnetnih zdravil (NSAID) pri človeškem CP in kroničnih glavobolih 10, 11 .

Metode

Živali in zdravljenje

Odrasli moški podgane Wistar (Harlan Nossan, Italija) so bili primerljivi glede na starost (8 tednov) in težo (250–300 g). Upoštevali smo osem skupin živali (slika 1): štiri skupine podgan so bile žrtvovane 2 tedna po operaciji: dve lažno operirani skupini, ki sta bili enkrat zdravljeni s fiziološko raztopino (n = 6) ali indometacinom (Liometacen, indometacina megluminska sol, pridobljena od Alfa Wassermann, Pescara, Italija, 2 mg / kg sc ) (n = 5) in dve skupini CCI, zdravljeni enkrat s fiziološko raztopino (n = 6) ali indometacinom (n = 7). Štiri tedne po operaciji so žrtvovali štiri skupine podgan, ki so jih 21 dni kronično zdravili (od 15. do 35. dneva po operaciji): dve lažno operirani skupini, ki sta bili kronično obdelani s fiziološko raztopino (n = 8) ali indometacinom (2 mg / kg sc / dan) (n = 10) in dve skupini CCI, ki sta bili kronično obdelani s fiziološko raztopino (n = 11) ali indometacinom (n = 11). Vse živali so bile žrtvovane z obglavljanjem ob isti uri dneva, da bi se izognili možnosti, da bi spremembe ravni izražanja beljakovin pripisali cirkadanskim ritmom, 6 ur po zadnjem zdravljenju. Vsa prizadevanja so bila zmanjšana za trpljenje živali in za zmanjšanje števila zaposlenih podgan.

Image

Navedeno je število podgan / skupine. Svetlo siva: nega fiziološke raztopine, temno siva: zdravljenje indometacina.

Slika v polni velikosti

Živali so bile nameščene v skupinah od dve do štiri in jih dnevno pregleduje glede okužb ali nenormalnega vedenja. V celotnem obdobju poskusov so jim omogočali prost dostop do hrane in vode in so bili pod nadzorovano temperaturo (22–25 ° C) in vlažnostjo z 12 h izmeničnih ciklov svetlo-temno.

Vsi postopki oskrbe živali in eksperimentalni postopki so bili izvedeni v strogem skladu s smernicami „Odbora za oskrbo živali“ Univerze v Modeni in Reggio Emilia (Italija), ki je študijo odobril, in so bili v skladu z direktivami italijanskega ministrstva Zdravje «(DL 116/92).

Podgana operacija

Podgane so bile podvržene tehniki CCI, ki sta jo razvila Bennett in Xie 15 . Eksperimentalni postopek je vključeval enostransko ligacijo išiasnega živca na ravni stegna desne zadnje šape. Podgane so globoko anestezirali z uporabo ketamina (110 mg / Kg, ip) in ksilazina (3, 6 mg / Kg, ip). Obrezanje je bilo najprej obrito, nato pa je bilo pod sterilnimi previdnostnimi ukrepi previdno izpostavljeno. Proksimalno glede na njegovo trifurkacijo so bile 4 ligature s svilenim šivom 3-0 ohlapno vezane okoli živca v intervalih približno 2 mm, tako da je bila dolžina obdelanega živca približno 8–10 mm, da se ohrani epinevrijska cirkulacija. Rana je bila zaprta s tremi zunanjimi šivi in ​​razkužena. Lažna operacija je bila sestavljena iz anestezije in kirurgije do izpostavljenosti sestričnega živca brez ligacije. V nekaj urah po operaciji so se pri podganah z vezanjem išiasnega živca pojavile spontane bolečine, ki so se manifestirale z varovanjem vedenja operirane šape in lizanjem na strani poškodbe. V naslednjih dneh so pokazali znake dvigovanja in luščenja šape, pretiranega negovanja in grizenja, ki so bili predlagani kot nocifenzivni znaki, ki kažejo na prisotnost spontane bolečine 24 . Poleg tega so podgane z išiatičnim ligacijskim živcem izkazovale znake alodinije do mehanske stimulacije, ocenjene s testom Von Frey 2 in 5 tednov po operaciji, v primerjavi z lažno operiranimi podganami (dopolnilna slika 1). Signali indikatorja bolečine so obstajali celotno trajanje poskusa. Avtotomija je bila odsotna v vseh primerih.

Priprava vzorca seruma za proteomsko analizo

Med odstranjevanjem živali se je odvzela kri v epruvetah za ločevanje seruma v vakuumih in se pustila strjevati pri sobni temperaturi 1 uro. Serum smo ločili s centrifugiranjem pri 2000 × g 10 min pri +4 ° C. Po dodajanju koktajla zaviralca proteaze (Sigma-Aldrich) za preprečitev encimskega razpada ali sprememb beljakovin smo vzorce razdelili na alikvote in jih do uporabe zamrznili pri –80 ° C. Da bi zmanjšali zapletenost vzorcev seruma pred proteomsko analizo, so jih zdravili s albumom ProteoPrep ® Imunoaffinity albumin in kompletom za izčrpavanje IgG (Sigma-Aldrich), ki posebej odstranjuje dva najpogostejša beljakovina v serumu, albumin in IgG25. Vsebnost beljakovin po izčrpanju je bila preizkušena s spektrofotometrično Bradfordovo metodo 26, pri čemer je bil standard govejega serumskega albumina (BSA) standard.

SDS-PAGE in dvodimenzionalna gel elektroforeza

Proteomsko analizo smo izvedli na vzorcih z osiromašenim serumom, najprej z elektroforezo natrijevega dodecil-sulfata-poliakrilamidnega gela (SDS-PAGE) in nato z dvodimenzionalno gel elektroforezo (2-DE). SDS-PAGE je bil izveden po Laemmlijevem postopku 27, pod znižanimi pogoji. Vzorce seruma (20 µg celotnih beljakovin) smo mešali z 2 × Laemmli-jevim pufrom (Bio-Rad), dopolnjenim z 0, 5% ditiotreitola (DTT). Vzorčne zmesi smo 5 minut vreli pri 95 ° C in nato naložili v 12% poliakrilamidne gele. Elektroforeza je bila dosežena z uporabo 1 × Tris-glicin-SDS (TGS) tekočega pufra pH 8, 3 (Bio-Rad), sprva pri 100 V 30 min, čemur je sledilo povečanje do 200 V. Beljakovine so obarvali s koloidno Coomassie Blue G -250 z inkubacijo preko noči pri rahlem stresanju in na koncu ohranimo z 10% metanolom / 5% ocetno kislino. Geli so bili narejeni v treh izvodih in različen odstotek akrilamida smo testirali, da dosežemo najboljšo ločljivost beljakovinskih pasov. Gel slike so bile pridobljene z uporabo kalibriranega denzitometra GS-800 (Bio-Rad) in analizirane s programom za analiziranje količine 1-D (različica 4.6.7, Bio-Rad), kot je bilo že poročano 28 . Na kratko, ta programska oprema zazna različno izražene proteine ​​med različnimi skupinami na podlagi intenzivnosti obarvanja pasov in pretvori signale iz vzorcev v digitalne podatke, ki so prikazani v sivi lestvici. Skupna intenzivnost pasu je izražena kot optična gostota (OD).

Vzorci seruma so bili podvrženi tudi 2-DE analizi. Beljakovine (80 µg) smo najprej razredčili z rehidracijskim pufrom (6 M sečnina, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 25 mM DTT, 0, 2% amfoliti) in nato naložili na 7 cm imobiliziranega pH gradientnega gradienta (IPG), pH 3–10 (Ready Strip ™, Bio-Rad). Beljakovine smo ločili z izoelektro fokusiranjem (IEF) pri 20 ° C, z začetnim pasivnim korakom rehidracije 16 ur, nato z naslednjim korakom IEF pri 500 V 30 minut, nato 5-minutnim posipanjem do 5000 V in na koncu fokusiranjem doseči 60000 Vh. Nato smo izvedli korak ravnotežja in ločitev druge dimenzije, kot je bilo že podrobno opisano 28 . Na koncu so bile beljakovinske pike vizualizirane po zgoraj opisanem protokolu obarvanja modrega Coomassieja. Geli so bili narejeni vsaj v treh izvodih, pri čemer so v drugi dimenziji testirali različno pH vrednost trakov in odstotek akrilamida, da smo dobili najboljšo ločljivost mesta. Slike gela smo pridobili s kalibriranim denzitometrom in analizirali s programom „PDQuest 2-D analiza programske opreme“ (različica 7.3.1, Bio-Rad). Ta programska oprema primerja dvodimenzionalne slike gela, da razkrije povečane ali zmanjšane beljakovinske lise glede na njihovo intenzivnost obarvanja, kot je predhodno opisano 10 . Spremembe številčnosti, tako za beljakovinske pasove kot za lise, so prikazane v tabelah kot sprememba beljakovinskega signala, ki se izračuna kot razmerje med vrednostmi intenzivnosti v koncentraciji fiziološke raztopine CCI ali indeksa CCI-indometacina proti lažno vodeni fiziološki raztopini.

Identifikacija beljakovin z masno spektrometrijo

Diferencialne pasove in lise so bile izločene iz gelov in podvržene protokolu prebave triptena "v gelu", kot je bilo že poročano 28, pred analizo masne spektrometrije (MS). Peptidne zmesi smo analizirali s sistemom Nano LC-Chip-MS, ki ga je oblikoval 6520 natančno-masni kvadrapolni čas tečne kromatografije / masne spektrometrije (Q-ToF LC / MS) skupaj z mikrofluidično napravo 1200 Nano HPLC-Chip. (Agilent Technologies, CA, ZDA), kot je bilo prej opisano 25 . Najvišji seznami za identifikacijo beljakovin so bili ustvarjeni s pomočjo iskalnika MASCOT (//mascot.cigs.unimore.it/mascot) z izbiro baze podatkov UniProtKB.

Kvantitativna verižna reakcija polimeraze v realnem času

Po obglavljanju živali so izločili striatum in ledveno hrbtenjačo, jih lizirali z mehansko motnjo v reaglu Trizol (Qiagen), homogenizirali po postopku proizvajalca (RNeasy Plus Mini Kit, Qiagen) in obdelali za količinski PCR (qPCR), kot je opisano 29 . Izolirano mRNA smo reverzno prepisali v cDNA z uporabo naključnih heksamerjev in M-MLV reverzne transkriptaze (Promega Corporation) po navodilih proizvajalca. Vzorce smo 5 minut segrevali pri 70 ° C, da smo odstranili morebitne sekundarne strukture, nato 10 minut inkubirali pri 23 ° C, 1 uro pri 37 ° C in 5 min na 95 ° C, preden smo jih s 4 termo ohladili s pomočjo termocikla T Gradient (Whatman, Biometra). Količino cDNA smo količinsko opredelili z iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) z uporabo Bio-Rad RT-PCR iCycler. Vsako reakcijo PCR smo izvedli v treh izvodih, pri čemer smo uporabili 150 nM vsakega temeljnega premaza, 10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), cDNA in vodo brez nukleaze z naslednjimi kolesarskimi parametri: 10 min pri 95 ° C in 40 ciklov 1 min pri 95 ° C, 1 min pri 60 ° C in 1 min pri 72 ° C, čemur sledi analiza krivulje taljenja. RT-PCR temeljni premazi so bili zasnovani v dveh različnih eksonih; dolžina temeljnega premaza je bila med 18 in 30 bp, vsebnost GC je bila med 40 in 60%, nespecifično žarenje in neusklajenost temeljnih premazov pa je bilo minimalizirano. Prisotnost nespecifičnih produktov pomnoževanja in pra-dimerov smo ovrednotili z analizo krivulje taljenja med validacijo temeljnega premaza RT-PCR. Naslednji primerji so bili uporabljeni za povečanje zanimivih prepisov:

GADPH Fw: 5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3 ′

GADPH Rv: 5′-ACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ′

PTGDS Fw: 5′-CAAGACAAGTTCCTGGGGCG-3 ′

PTGDS Rv: 5′-GTGCCAGACAGTGGTAGCTC-3 ′

TTR Fw: 5′-TCGATGTGGCCGTGAAAGTG-3 ′

TTR Rv: 5′-CGGAAGGGGTGTACAGGGTA-3 ′

APOE Fw: 5′-TTGGTCCCATTGCTGACAGG-3 ′

APOE Rv: 5′-GCGCAGGTAATCCCAGAAGC-3 ′

APOA1 Fw: 5′-TCTTCCTGACAGGTTGCCAAG-3 ′

APOA1 Rv: 5′-TGGCGAAATCCTTCACCCTG-3 ′

A1M Fw: 5′-GGACAGACAGTGAAATTCCGAG-3 ′

A1M Rv: 5′-GCAGTCCTCCTGGTAGATCG-3 ′

VDBP Fw: 5′-GGAAAGGAAAAATCAAGGATGAGCC-3 ′

VDBP Rv: 5′-ATGTGTGTTCAGGCAGCTCTC-3 ′

APOA4 Fw: 5′-CCAAGGAGGCTGTGGAACAA-3 ′

APOA4Rv: 5 '-CACTCAGTTGAACGGCGAAG-3'

Pokazalo se je, da vsi primeri učinkovito prepoznavajo svojo ciljno mRNA z uporabo pozitivnih kontrolnih tkiv hrbtenjače (APOA1, APOE, PTGDS, VDBP), hipotalamusa (TTR) 30 ali jeter (APOA4, A1M).

Presežne razlike v izražanju so bile izračunane s primerjalno metodo, imenovano tudi ΔΔCt metoda 29 . Kot referenčni vzorec ali kalibrator je bil uporabljen vzorec lažne fiziološke raztopine.

Analiza podatkov

Vsi podatki so predstavljeni kot srednja ± standardna napaka srednje vrednosti. Statistične primerjave so bile izvedene z dvotirno analizo variacije (ANOVA), pri čemer je bila vrednost p ≤ 0, 05 statistično pomembna.

Rezultati

SDS-PAGE analiza serumskih beljakovin

Denzitometrična analiza s programom QuantityOne je pokazala več pasov, ki so različno izraženi (slika 2). Te trakove smo razrezali iz gela in analizirali z MS. V skupini podgan CCI, ki so bile zdravljene s fiziološko raztopino, se je 5 tednov po operaciji pojavilo šest beljakovinskih pasov, v primerjavi s podložnimi podganami, ki so bile zdravljene s fiziološko raztopino, medtem ko se je en od teh trakov že dva tedna po podganah CCI povečal operacija. Te spremembe so bile delno spremenjene z zdravljenjem z indometacinom (tabela 1).

Image

Poročilo o prometnih pasovih: MW marker, Molekularna teža proteinske lestve (BenchMark); Sham-op fiziološka raztopina = lažno operirana skupina, obdelana s fiziološko raztopino; sramotno indomet. = lažno operirana skupina, zdravljena z indometacinom; CCI-fiziološka raztopina = vezana skupina, obdelana s fiziološko raztopino; CCI-indeks. = ligirana skupina, zdravljena z indometacinom, v 2 in 5 tednih po operaciji. Proteinski pasovi, različno izraženi med različnimi skupinami, ki jih analizira Q-ToF LC / MS, so zaprti v pravokotnike: A1AT: Alpha-1-antitripsin, VDBP: protein, ki veže vitamin D, APOA4: apolipoprotein A-IV, KCRM: Kreatin kinaza M -tip, HPT: Haptoglobin, APOE: Apolipoprotein E, CRP: C-reaktivni protein, APOA1: Apolipoprotein AI, GPX3: Glutation peroksidaza 3, PRDX2: Peroxiredoxin-2.

Slika v polni velikosti

Tabela polne velikosti

Analiza MS seruma podgan v 5 tednih po operaciji je odkrila naslednje beljakovine, navedene v preglednici 1: alfa-1-antitripsin (A1AT), protein, ki veže vitamin D (VDBP), apolipoprotein A-IV (APOA4), kreatin kinaza M-tip (KCRM), haptoglobin (HPT), apolipoprotein E (APOE), C-reaktivni protein (CRP), apolipoprotein AI (APOA1) in 2 encimov, glutation peroksidaza 3 (GPX3) in peroksiredoksin-2 (PRDX2). Proteinski pas, ki vsebuje HPT in APOE, se je povečal tudi pri podganah CCI, ki so bile zdravljene s fiziološko raztopino 2 tedna po operaciji (slika 2, tabela 1).

V preglednici 1 so navedeni samo proteini, ki prikazujejo najvišjo ionsko oceno in peptidno ujemanje, pa tudi večjo pokritost zaporedja, ki jo je v zbirki UniProtKB pridobil iskalnik MASCOT (MS / MS ionsko iskanje). Rezultat se izračuna kot [−10 × log ( P )], kjer je P verjetnost, da je opaženo ujemanje med eksperimentalnimi podatki in zaporedjem baze podatkov naključni dogodek; ujemanje peptidov se nanaša na skupno število peptidov, ki ustrezajo identificiranemu proteinu; pokritje zaporedja označuje odstotek aminokislin, zaporednih za odkriti protein. Poleg tega je bil še en parameter, ki je bil upoštevan pri izbiri beljakovin, MW; beljakovine z MW, ki niso v skladu s tistimi, ki jih označuje standard MW marker, niso bili upoštevani.

Dvodimenzionalna gel elektroforeza serumskih beljakovin

2-DE v povezavi z analizo MS je potrdilo nekatere podatke, pridobljene s SDS-PAGE, in omogočilo identifikacijo in oceno s pomočjo programske opreme za obdelavo slik PDQuest (Bio-Rad), ki so nadalje diferencirano eksprimirani v obeh in petih tednih. (Sliki 3 in 4, tabela 2 in 3). V 2 tednih po operaciji se je raven 3 beljakovin v skupini CCI-fiziološke raztopine povečala za 9–10, 5-krat v primerjavi z lažno podganimi podganami, zdravljenimi s fiziološko raztopino: VDBP, APOA4 in alfa-1-makroglobulinom (A1M). Akutno zdravljenje z indometacinom je to povečanje popolnoma obrnilo (sl. 3 in tabela 2).

Image

Ločitev prve dimenzije smo dobili s trakom IPG, pH vrednost 3–10; ločitev druge dimenzije je bila dosežena z gradientnim gelom 8–16%. ( A ) lažno operirana skupina, ki se zdravi s fiziološko raztopino, ( B ) lažno operirana skupina, zdravljena z indometacinom, ( C ) fiziološkim raztopinami CCI, ( D ) CCI-indometacinom. Na plošči C pravokotniki označujejo povečane beljakovine v primerjavi s ploščo D, identificirane z MS in navedene v tabeli 2 (VDBP: protein, ki veže vitamin D, APOA4: apolipoprotein A-IV, A1M: alfa-1-makroglobulin).

Slika v polni velikosti

Image

Ločitev prve dimenzije s trakom IPG, območje pH 3–10, ločitev druge dimenzije z gradientnim gelom 8–16%. ( A ) lažno operirana skupina, ki se zdravi s fiziološko raztopino, ( B ) lažno operirana skupina, zdravljena z indometacinom, ( C ) fiziološkim raztopinami CCI, ( D ) CCI-indometacinom. Na plošči C pravokotniki označujejo povečane beljakovine v primerjavi s ploščo D, identificirane z MS in navedene v tabeli 3 (VDBP: protein, ki veže vitamin D, A1M: alfa-1-makroglobulin, APOA1: apolipoprotein AI, PTGDS: prostaglandin-H2 D- izomeraza, TTR: transsteretin, APOE: Apolipoprotein E).

Slika v polni velikosti

Tabela polne velikosti

Tabela polne velikosti

V 5 tednih po operaciji sta se raven dveh beljakovin, identificiranih v 2 tednih po operaciji, VDBP in A1M, še vedno zvišala (približno 8, 5 oziroma 6-krat več) v CCI-fiziološki raztopini glede na lažno operirano podgane, obdelane s fiziološko raztopino. Poleg tega so bile ravne 4 dodatnih beljakovin povišane pri liganih podganah, ki so bile zdravljene s fiziološko raztopino, kar ustreza prostaglandin-H2 D-izomerazi (PTGDS, 7, 5-kratno povečanje), transtiretinu (TTR, 20-kratno povečanje), APOA1 (22, 5-krat) povečanje) in APOE (3, 3-kratno povečanje), kot je prikazano na sliki 4 in opredeljeno v tabeli 3. Kronično zdravljenje indometacina bi lahko to povečanje bistveno povrnilo z izjemo APOE, katerega ravni so ostale povišane.

Kvantitativna PCR analiza centralnih živčnih tkiv

Beljakovine, katerih nivoji so v serumu liganih podgan, lahko izvirajo iz več virov v telesu. Razločna možnost je, da nekateri od njih izhajajo iz ledvene hrbtenjače na nivoju korenine išiasnega živca. Za preizkus te hipoteze smo s pomočjo qPCR izmerili v ledvenem delu hrbtenjače raven mRNA 7 proteinov, katerih ravni so bile spremenjene v serumu istih živali. Trijeh zapisov, TTR, APOA4 in A1M, v ledveni hrbtenjači niso zaznali. Namesto tega so v izvlečku iz ledvene hrbtenjače odkrili PTGDS, APOE, APOA1 in VDBP in se različno izrazili v različnih skupinah zdravljenja. Kar zadeva PTGDS, med dvema tedenskima skupinama zdravljenja po operaciji ni bilo ugotovljene pomembne razlike (dvosmerna ANOVA, lezija F (1, 11) = 2, 051, p = 0, 180; zdravilo F (1, 11) = 0, 566, p = 0, 467; lezija × zdravilo F (1, 11) = 0, 161, p = 0, 696), medtem ko je bilo v podganah CCI, ki so bile kronično zdravljene s fiziološko raztopino, v 5 tednih po operaciji značilno povečanje za približno 9-krat. zmanjšan z zdravljenjem z indometacinom (dvosmerna ANOVA, lezija F (1, 18) = 6, 486, p = 0, 020; zdravilo F (1, 18) = 4, 409, p = 0, 050; lezija × zdravilo F (1, 18) = 4, 545, p = 0, 049) (slika 5).

Image

Ravni APOA1, APOE, PTGDS in VDBP mRNA so bile izmerjene v ledveni hrbtenjači podgan, 2 ali 5 tednov po CCI sestričnega živca. Podatke smo analizirali s pomočjo dvosmerne ANOVA, pri čemer so bili dejavniki lažno delovanje / ligacija in fiziološka raztopina / indometacin, kar je pokazalo pomembno interakcijo za vse 4 mRNA v 5-tedenskih skupinah.

Slika v polni velikosti

Podoben, čeprav manj intenziven učinek (približno 5-krat) je bil zaznan pri APOE (dvosmerna ANOVA, dvotedenska zdravljenja: lezija F (1, 11) = 0, 996, p = 0, 340; zdravilo F (1, 11) = 0, 134, p = 0, 721; lezija × zdravilo F (1, 11) = 1, 136, p = 0, 309; 5 tedensko zdravljenje: lezija F (1, 18) = 9, 952, p = 0, 006; droga F (1, 18) = 4, 204, p = 0, 057; lezija × zdravilo F (1, 18) = 5, 690, p = 0, 030) (slika 5).

Namesto tega smo za mRNA APOA1 in VDBP odkrili drugačen vzorec učinka. V 2 tednih po operaciji so zaznali pomemben, čeprav skromen učinek ligacije, ki ga zdravljenje z indometacinom ni odpravilo (dvosmerna ANOVA, APOA1: lezija F (1, 11) = 5, 093, p = 0, 045; zdravilo F ( 1, 11) = 1, 587, p = 0, 234; lezija × zdravilo F (1, 11) = 0, 402, p = 0, 539; VDBP: lezija F (1, 11) = 5, 016, p = 0, 047; droga F (1, 11) = 0, 001, p = 0, 970; lezija × zdravilo F (1, 11) = 0, 009, p = 0, 926). V 5 tednih po operaciji je bilo pri podganah CCI prisotno znatno povečanje za APOA1 in VDBP za približno 6- in 9-krat, ki jih je zdravljenje z indometacinom zmanjšalo (dvosmerna ANOVA, APOA1: lezija F (1, 18 ) = 6, 384, p = 0, 022; droga F (1, 18) = 2, 608, p = 0, 123; lezija × zdravilo F (1, 18) = 4, 569, p = 0, 048; VDBP: lezija F (1, 18) = 6, 288, p = 0, 024; droga F (1, 18) = 2, 836, p = 0, 113; lezija × zdravilo F (1, 18) = 3, 813, p = 0, 070) (slika 5).

Kot kontrolo smo v striatumu izmerili ravni istih 7 mRNA. V tej regiji 5 od sedmih prepisov, ki smo jih obravnavali (TTR, APOA4, A1M, APOA1 in VDBP), nismo zaznali. APOE in PTDGS sta bila zaznana na ravneh, ki so primerljive in nižje kot v ledvenem delu hrbtenjače. Kar zadeva APOE in PTGDS, v nobeni skupini zdravljenja 5 tednov po operaciji ni bilo odkrite (APOE: lezija F (1, 23) = 0, 786, p = 0, 385; zdravilo F (1, 23) = 1, 005, p = 0, 326 ; lezija × droga F (1, 23) = 0, 009, p = 0, 925; PTGDS: lezija F (1, 22) = 0, 554, p = 0, 464; droga F (1, 22) = 0, 549, p = 0, 467; lezija × droga F (1, 22) = 0, 193, p = 0, 665) (dopolnilna slika 2).

Diskusija

Glavni rezultat te študije je identifikacija s proteomskim pristopom več beljakovin v serumu, ki so v modelu CCI vezave išiasnega živca pri podganah izrazito prekomerno izraženi. Prekomerna ekspresija beljakovin se je delno razlikovala v 2 in 5 tednih po operaciji in je bila občutljiva na zdravljenje z indometacinom. Natančneje, ravni A1M, APOA4 in VDBP so se 2 tedna po ligaciji živcev izrazito zvišale; medtem ko so ravni APOA4 padle na lažno kontrolirane ravni, sta nivoja A1M in VDBP še naprej naraščala v 5 tednih po operaciji. Poleg tega so v tej zadnji točki zaznali povečano raven nadaljnjega nabora beljakovin: APOA1, APOE, PTGDS in TTR. Poleg tega smo začeli iskati možne vire v telesu serumskih beljakovin, prikazanih tukaj, da bi prekomerno izrazili. Preiskavo smo osredotočili na ledveno hrbtenjačo, mesto nastanka in prenehanja motoričnih in senzoričnih komponent išiasnega živca in striatum, nepovezano možgansko regijo, kjer smo predhodno merili s transkriptom qPCR 7 proteinov dokazano, da je pri proteomski analizi prekomerno izražen. Štirje od teh prepisov, APOA1, APOE, PTGDS in VDBP, so bili izraženi v hrbtenjači in so se 5 tednov po operaciji izrazito in selektivno zvišali v CCI-fiziološki raztopini. V striatumu ni bilo opaziti bistvene spremembe v nobenem od prepisov. Lumbalna hrbtenjača je torej možen vir več beljakovin, ugotovljenih v serumu podgan 5 tednov po ligaciji išiasnega živca.

Dosedanje študije so pokazale, da se znaki hiperalgezije in sprememb, povezanih z degeneracijo / regeneracijo živcev, v različnih časovnih intervalih razlikujejo od ligacije išiasnega živca. V modelu CCI so znaki hiperalgezije, kot je trajanje popuščanja šape pri več preskusih bolečine (nevtralna plošča, vroča plošča, pribrizganje zatiča, aceton sprej ali hladna plošča), kot tudi odpornost na pritisk pri testu Von Frey, ostali nespremenjeni pri 2 in 5 tednov po ligaciji 21 in sta bila podobna ali nekoliko nižja glede na prve dni po operaciji, kar kaže, da se raven hiperalgezije v bistvu ohranja med 2 in 5 tedni po ligaciji. Po drugi strani pa je študija degenerativnih / regenerativnih procesov ligiranega išiasnega živca pokazala zapleten vzorec sprememb po operaciji22. V drugem tednu po ligaciji je največja degeneracija meleliziranih vlaken skupaj z izgubo nemeliniranih vlaken in sintetičnih vlaken dosegla vrhunec v drugem tednu po ligaciji. Medtem ko so oslabljeni znaki degeneracije živca obstajali v naslednjih tednih do 15 tednov po ligaciji, so od tretjega tedna odkrili znake progresivne regeneracije živcev, tako da se je v 5 tednih po ligaciji del živčnih morfoloških značilnosti delno okreval. Skladno s tem so se senzorične in motorične hitrosti prevodnosti živcev začele obnavljati 2 tedna po poškodbi 31 . Omeniti velja, da večine primerov prekomerne ekspresije beljakovin v serumu in ustreznih vrednosti mRNA v hrbtenici niso opazili v 2 tednih po ligaciji, obdobju, ko je bil odkrit vrhunec degenerativnih procesov, vendar v 5 tednih po ligaciji, ko so bili intenzivni znaki regeneracije (tudi) odkrita.

Proteini, za katere smo ugotovili, da so prekomerno izraženi 2 in / ali 5 tednov po ligaciji išiasnega živca, so bili predhodno vpleteni v bolečine, vnetne ali regenerativne procese.

A1M spada v družino alfa makroglobulinov, skupino velikih glikoproteinov, ki zavirajo vse vrste proteinaz z lovilnim mehanizmom 32 . Ugotovljeno je bilo, da je bil ta protein prekomerno izražen v 2 in 5 tednih po poškodbi in ima lahko različne funkcije. V modelih akutnega vnetja 33, 34, 35 je bilo dejansko nadzorovano in je sodelovalo pri regeneraciji živcev, saj je bilo dokazano, da v in vitro in obnavljanju išiastega živca pri podganah spodbuja nevritni izrastki embrionalnih možganskih kortikalnih nevronov vivo ter rast nevrita, ki ga spodbuja rast živčnega faktorja, v celicah PC12 feokromocitoma 36 .

Pri CCI podganah smo zaznali prekomerno ekspresijo več apolipoproteinov, tj APOA4, APOA1 in APOE. Med regeneracijo živcev so potrebne velike količine lipidov za aksonsko regeneracijo in remielinacijo. Menijo, da lipoproteini, ki izvirajo iz razpada aksona in mielina v poškodovanih perifernih živcih, dobavljajo holesterol obnavljajočim se aksonom 37 . V skladu s tem so ugotovili povečano raven štirih apolipoproteinov, vključno z APOD, APOA4, APOA1 in APOE, v izvlečkih poškodovanega išiasnega živca, s čimer se je dokazalo njihovo kopičenje v regenerativnih perifernih živcih 12, 38, 39 . V naši raziskavi smo z 2-DE analizo ugotovili povečano serumsko raven APOA4 selektivno v 2 tednih po operaciji, medtem ko smo APOA1 in APOE ugotovili selektivno prekomerno izraženo v 5 tednih po operaciji. To je v veliki meri s Jiménez in sod . 12, ki so pokazali, da se APOA4 po poškodbi prehodno poveča, medtem ko se APOA1 in APOE postopno povečata do 35 dni po poškodbi. Kot smo že omenili, se po poškodbi živca poveča potreba po lipidih in apolipoproteini iz različnih virov igrajo ključno vlogo pri zahtevanem prenosu holesterola 39 . Verjetno se APOA4 proizvaja v zgodnji fazi poškodbe, med degeneracijo živca kot odgovor na denervacijo. Ko se v drugem in tretjem tednu po poškodbi začnejo procesi remelinizacije in regeneracije in sočasno Schwannove celice izčrpajo zaloge holesterola 39, postane lipidni transport aktivnejši. Consequently, further proteins increase, such as APOA1 and APOE. This latter is a 34 kDa glycoprotein known to influence degenerative, as well as regenerative events in the peripheral nervous system 40 . After peripheral nerve injury, axons degenerate and Schwann cells reabsorbe myelin; at the same time, APOE synthesis by resident and monocyte-derived macrophages and by endothelial cells increase greatly, leading to APOE accumulation within the nerve 39, 41, 42 . All these reports support the concept that APOE is involved in re-utilization of cholesterol from degenerating nerves for axonal repair and reconstruction of axonal and myelin membranes (regeneration process) 37, 43 . These sets of evidence point to a potential role of APOE in functional recovery and/or reduction of neuropathic pain after peripheral nerve damage 44 .

TTR (also called prealbumin) is an ubiquitous protein, present in both the cerebrospinal fluid and serum, with a specific role in the transport of thyroid hormones and, indirectly, of retinol 45 ; it is highly expressed in choroid plexus epithelial cells and has been detected in retina pigment epithelium and in the liver (UniProtKB database). TTR is not thought to be expressed by neurons (present data) (Allen Mouse Brain Atlas (ABA), //mouse.brain-map.org) 46, but is expressed by Schwann cells 47 . Increased levels of TTR in CCI-saline rats 5 weeks post-surgery may be related to regeneration processes. An involvement of TTR has been reported in sensorimotor, post-traumatic nerve fiber regeneration, axonal growth enhancement during peripheral nervous system regeneration, and neuroprotection in Alzheimer's disease 48, 49, 50 .

Another protein overexpressed 5 weeks after surgery in CCI-saline rats is PTGDS; its overexpression may be particularly relevant as a pathogenic mechanism for production and/or maintenance of hyperalgesia. PTGDS, also known as β-trace protein, is a glutathione-independent prostaglandin D synthase that catalyzes the conversion of prostaglandin H2 (PGH2) to prostaglandin D2 (PGD2) and is involved in various physiological functions, such as vasodilation, thermoregulation, smooth muscle contraction and relaxation, sleep induction and sedation, regulation of immune response, mediation of cellular homeostasis and modulation of nociception 51, 52 . PGD2 represents the most abundant prostanoid produced in CNS of mammals 53 . Some studies conducted on animal models have proved that prostaglandins play fundamental roles in central sensitization at spinal level, resulting in induction of hyperalgesia and cutaneous allodynia 54, 55 . In particular, it has been reported that PTGDS-deficient mice lack tactile pain and allodynia 56, and have reduced pain hypersensitivity 57 .

VDBP was overexpressed both at 2 and 5 weeks after nerve injury in CCI-saline vs sham-operated saline. VDBP is a major plasma constituent in a broad range of animal species. It is a monomeric glycoprotein synthesized and secreted by the liver, which transports vitamin D sterols and metabolites 58 . It has other functions, including the ability to bind monomers of actin with high affinity, sequestering them from polymerization, and to associate with membrane-bound immunoglobulins on the surface of B-lymphocytes 59 . Of relevance in the present context is the possible involvement of VDBD and vitamin D in nerve regeneration 60, 61 and pain mechanisms. In fact, vitamin D is thought to influence pain manifestation, playing a role in the aetiology and maintenance of CP states and associated comorbidities 62 . Interestingly, it has been demonstrated that vitamin D inadequacy is associated with medication refractory muscoloskeletal pain and neuromuscolar dysfunction among patients with CP 63, and treatment with vitamin D can alleviate pain in a majority of the patients with vitamin D deficiency 64 . In addition, another study reported a possible relationship between dysfunction of VDBP and migraine attacks 65 .

To sum up, while the changes in A1M, TTR, APOA4, APOA1 and APOE may participate to nerve cell regeneration through local supplementation of lipids and other unknown mechanisms, alterations in VDBP and PTGDS may play a pathogenic role in the mechanisms of central pain hypersensitivity. In particular, spinal production of PGD2 is thought to cause hyperalgesia and allodynia 66 .

Previous proteomic studies in biological liquids, such as urine 10, 11, cerebrospinal fluid 9, 67, muscle interstitial fluid 68 of subjects suffering CP reported increased levels of most of the proteins that we found overexpressed in the serum of rats 5 weeks after ligation, including PTGDS 9, 11, 67, TTR 9, 10, 68, APOE 9, VDBP 67 and APOA1 9, 68 . This evidence points to CCI at late post-surgery time intervals as a highly relevant animal model of human CP states. Indeed, it suggests that proteomic markers found in human studies do not reflect hyperalgesic states per se but rather are associated to CP states where chronic degenerative and regenerative processes coexist in affected nerves. The isomorphism between animal model and human pathological state opens up the possibility to study in depth and mechanistically the origin and function of these proteins and attribute them a role as markers of specific features of CP and related pathologies.

Notably, an acute or chronic (3 weeks) treatment with indomethacin was able to reverse most of the observed changes in protein expression at 2 or 5 weeks post-surgery. This evidence suggests that the processes leading to the observed CCI-induced increases in serum proteins are controlled by molecular targets modulated by indomethacin, a powerful NSAID with non-selective inhibitory activity on cyclooxygenase 1 and 2 23 . Besides common NSAID-like effects, indomethacin is thought to have specific, though not well known, pharmacological actions as suggested by the existence of a set of diseases involving CP that are exquisitely responsive to indomethacin 69 . Comparison of several NSAIDs in the present paradigm may help define possible selective actions and targets of NSAIDs in CP states.

In conclusion, using an animal model of chronic neuropathic pain, this study demonstrates an increased expression of specific serum proteins, several of which were shown to be overexpressed in biological fluids of patients suffering CP. This close correspondence between proteins overexpressed in biological fluids of patients with CP and rats with chronic neuropathic pain opens up the possibility of an in depth study of the origin and pathophysiological significance of CP biomarkers.

Dodatne informacije

How to cite this article : Bellei, E. et al . Serum protein changes in a rat model of chronic pain show a correlation between animal and humans. Sci. Rep. 7, 41723; doi: 10.1038/srep41723 (2017).

Opomba založnika: Springer Nature ostaja nevtralen glede zahtev glede pristojnosti v objavljenih zemljevidih ​​in institucionalnih pripadnostih.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.