Resekcioniranje genov ccl5 in ccr5 in raziskava različic za povezavo z diabetično nefropatijo | časopis za človeško genetiko

Resekcioniranje genov ccl5 in ccr5 in raziskava različic za povezavo z diabetično nefropatijo | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Diabetična nefropatija
  • Genska variacija
  • Zaporedje

Izvleček

Ligand 5 ( CCL5 ) za hemokin (C – C) in receptor za hemokin (C – C motiv) 5 sta vpletena v patogenezo diabetične nefropatije (DN). Predpostavljamo, da so različice teh genov lahko povezane z DN. Geni CCL5 in receptorjev za hemokine tipa 5 ( CCR5 ) so bili resekcionirani, različice so bile identificirane ( n = 58), alelne frekvence, določene pri 46 posameznikih (92 kromosomov) in učinkoviti haplotipistični polimorfizmi z enim nukleotidom (htSNP), izbrani za učinkovito oceno skupne variacije v teh genih. Ena različna funkcionalna genska varianta in osem htSNP so bili genotipizirani v študiji povezovanja v primeru primera, ki je vključevala kavkaške posameznike s sladkorno boleznijo tipa 1 (267 primerov z DN in 442 nefropatskih kontrolnih diabetikov). Genotipizacija je bila izvedena z uporabo MassARRAY iPLEX, TaqMan, gel elektroforeze in direktnega zaporedja kapilar. Po popravku za večkratno testiranje ni bilo statistično pomembnih povezav med različicami genov CCL5 in CCR5 in DN.

Glavno

Diabetična nefropatija (DN) je glavni vzrok za končno stopnjo ledvične bolezni v zahodnem svetu 1 s pomembnimi dokazi, da je podvrsta bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 1 genetsko nagnjena k razvoju DN. 2 ligand 5 hemokina (C – C motiv) (alternativno znan kot reguliran po aktivaciji, normalno T-celica, izražena in izločena; CCL5 ) in njen kognatni receptor, hemokinski receptor tipa 5 ( CCR5 ), sta biološka kandidata za DN.

CCL5 je močan kemoatraktant, ki ga proizvajajo ledvične mezangialne celice, ki je aktiven pri rekrutaciji monocitov in makrofagov v glomeruli in intersticij. CCL5 je odvisen od jedrskega faktorja -κB in ga regulira proteinurija 3 in drugi dejavniki, povezani z diabetičnim miljejem. 4, 5, 6 Blokade CCR5 dokazano bistveno zmanjšajo infiltracijo monocitov pri eksperimentalnem glomerulonefritisu. 7 CCL5 in CCR5 sta bila deležna veliko pozornosti kot kandidatna gena za DN, čeprav so se te študije osredotočile na izbrane različice z nedoslednimi ugotovitvami. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

Lokus gena CCL5 je bil dodeljen 17q11.2-q12, 16 in gen CCR5 je lociran na kromosomu 3p21. 17 Kodirajoča območja, intronsko-eksonske meje, neprevedena in bočna območja genov CCL5 in CCR5 so bila celovito pregledana za prepoznavanje polimorfizmov, zato je bila izvedena robustna študija nadzora primerov za oceno povezave med običajnimi označevanjem haplotipov ali funkcionalnimi različicami in DN v kavkaška populacija s sladkorno boleznijo tipa 1.

Zbirka irskega nadzora nad primeri, ki smo jo preučili v tem prispevku, je bila že opisana. 18 Na kratko, primeri imajo diabetes tipa 1 z DN, medtem ko so kontrolni bolniki z diabetesom tipa 1 brez nefropatije. Povprečna starost ob zaposlovanju primerov in kontrol je bila 48, 7 (sd 9, 6) in 42, 2 (sd 11, 7) let, povprečno trajanje bolezni pa 32, 0 (sd 9, 6) let za primere in 27, 2 (sd 9, 3) let za kontrole.

Referenčni zaporedi CCL5 in CCR5 (kromosom pristopne številke: NCBI35: 17: 31217613: 31236490: 1 in kromosom: NCBI35: 3: 46381637: 46396695: 1) sta bili pridobljeni od Nacionalnega centra za informacije o biotehnologiji (//www.ncbi .nlm.nih.gov). Za določitev mej eksona-introna smo uporabili referenčne mRNA (CCL5, NM_002985, GI: 22538813; CCR5, NM_000579, GI: 4502638). Fragmente, ki se prekrivajo (povprečna dolžina = 674 bp) smo PCR amplificirali z uporabo genomske DNK iz 23 primerov in 23 kontrolnih vzorcev. Primerji in pogoji PCR so na voljo pri avtorjih. Dvosmerno sekvenciranje, presejalni pregledi za variante, izbira eno-nukleotidnega polimorfizma (htSNP) oznake haplotipa in genotipizacija so bili izvedeni, kot je opisano prej. 18

Podatki o ponovnem testiranju so bili poslani GenBank kot (a) gen GQ504011 C – C hemokin ligand 5 ( CCL5 ), promocijsko območje in celotni CD-ji ter kot (b) GQ917109 C – C hemokin receptor tipa 5 ( CCR5 ) in popolni CD . Novi SNP-ji so bili poslani v dbSNP (tabela 1).

Tabela polne velikosti

Pregledali smo skoraj 6 kb gena CCL5 , vključno z vsemi eksoni, mejami eksona-intra in neprevedenimi regijami. Naši podatki o ponovnem iskanju so ugotovili štiri razlike v primerjavi z referenčnim zaporedjem GenBank za CCL5 (c.-881G> A, c.-641A> G, c.-534delC in c.-518delA). V vseh 13 novih SNP je bilo ugotovljenih, od tega je bilo 11 manjše frekvence alelov <5%. V ekraniziranih območjih CCL5 je bilo ugotovljenih 27 variant (tabela 1). Za oceno frekvenc haplotipa (dodatna slika 1) so bili uporabljeni genotipi za 10 SNP z MAF> 5% v 23 primerih in 23 kontrol. Z uporabo Sequenom MassARRAY iPLEX (Sequenom, San Diego, CA, ZDA) in neposrednim kapilarnim zaporedjem v naši zbirki primerov-nadzora je bilo identificiranih osem haplotipov in trije htSNP.

V približno 9 kb ekraniziranega CCR5 so identificirali šest novih SNP-jev, od katerih je bilo pet MAF <5%. Skupno je bilo identificiranih enaindvajset variant (tabela 1), od katerih jih je bilo 22 uporabljenih za oceno frekvenc haplotipa (dodatna slika 1). Frekvencije haplotipa so bile pridobljene iz snphap in vnosa v Stata, v katerem je bil ukaz htsearch uporabljen za identifikacijo htSNP. Opaženih je bilo dvanajst haplotipov in izbranih pet htSNP, vključno s CCR5_ rs333, brisanje z 32 bp, o katerem poročajo, da daje odpornost na HIV. 19 Za genotipizacijo je bil izbran en dodaten SNP ( CCR5 _rs1799987) na podlagi predhodne povezave z DN, 8, 9, 10, 11, 12, 13 in domnevne funkcionalnosti. 19 Izbrani SNP so bili genotipizirani v irski zbirki primerov nadzora, ki je dovolj velika, da je zagotovila približno 80-odstotno moč za zaznavanje razmerja kvot (OR) 1, 6, z MAF 10%. Pri nobenem SNP ni bilo odstopanja od ravnotežja Hardy-Weinberg ( P > 0, 001). Zbirka za nadzor primerov je bila izbrana s strogimi fenotipskimi merili in je bila predhodno uporabljena za raziskovanje povezanosti z DN. 18, 20, T in c.-546C> G z diabetično nefropatijo pri sladkorni bolezni tipa 1. Diabet. Med. 25, 1127–1129 (2008). "Href = / Članki / jhg201015 # ref21 aria-label =" Referenca 21 "data-track = kliknite data-track-label = link> 21

Za vse genotipirane SNP je bil dosežen več kot 95% zaključka. Za primerjavo genotipov in alelnih frekvenc med primeri in kontrolnimi skupinami smo uporabili tabelo izrednih primerov χ 2 .

Najdenih ni bilo nobenih variant CCL5, ki bi bile povezane z DN (tabela 2). Genotip CCR5_ rs7637813 AA je bil pogostejši pri kontrolah kot v primerih (50, 5 v primerjavi z 42, 1%; P = 0, 04, tabela 2). Analiza haplotipov z uporabo Haploview 18 je razkrila, da so bili v kontrolni skupini pogostejši tudi haplotipi CCR5 rs7637813A, rs10577983Ins, rs2227010A, rs333Ins in rs17765882T (8, 9 v primerjavi s 5, 8%; P = 0, 03, dodatna tabela 1). Prilagoditev za več primerjav z uporabo Bonferronijeve korekcije teh P- vrednosti ni pomenila.

Tabela polne velikosti

Utemeljitev te preiskave podpirajo tako in vitro kot in in vivo študije, skupaj s predhodnimi poročili o združenju DN. Preiskave japonske in azijske indijske populacije kažejo na povezavo med CCR5_ rs1799987 (alias 59029G> A) in DN ter ledvično insuficienco pri populaciji diabetikov tipa 2. 8, 11, 12, 13 CCR5_ rs1799987 je domnevno funkcionalna varianta, ki se nahaja v promocijskem območju, ki vpliva na izražanje proteina CCR5. 19 Ker je CCR5_ rs1799987 najpogosteje raziskani SNP v prejšnjih publikacijah, je bil za to varianto izveden izračun velikosti vzorca. Naša zbirka nadzora nad primeri je dovolj velika, da daje približno 80% moči za zaznavanje statistično pomembnega ( P <0, 05) ALI 1, 4 za alel A za CCR5 CCR5_ rs1799987 in ALI 1, 6 za vsako mesto, od katerega je mladoletnik pogostost alelov presega 10%. Haplotipi tveganja CCR5_ rs1799987 in CCR5_ rs333 so bili povezani z DN pri samo kavkaskih sladkornih bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 1; 10 naša raziskava tega ni podprla (podatki niso prikazani). Opisane so tudi nekatere druge nasprotujoče si ugotovitve. 14, 15

Objavljene študije o povezavi CCL5 in CCR5, izvedene do danes, so bile osredotočene na eno ali dve izbrani različici gena, ki sta bili pogosto izbrani na podlagi funkcije. Izvedena je bila metaanaliza, ki je vključevala podatke iz teh poročil 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ki so raziskovali tri loke, pomembne za našo študijo: CCL5_ rs2107538 (združeni ALI 0, 99; 95% CI 0, 80–1, 23; P = 0, 94), CCR5_ rs1799987 (združeni ALI 0, 96; 95% CI 0, 78–1, 17; P = 0, 66) in CCR5_ rs333 (združeni ALI 0, 96; 95% CI 0, 78–1, 19; P = 0, 73). Treba je opozoriti, da študije, ki preučujejo CCR5 _rs1799987, kažejo heterogenost tudi po izključitvi podatkov, ki sta jih poročala Ahluwalia et al. , 13, ki so pokazali zelo izrazita odstopanja od ravnotežja Hardy-Weinberg. To kaže, da pri tej analizi rezultati različnih raziskav niso bili skladni. Nadaljnje podrobnosti so na voljo na dodatni sliki 2. Skupno ni bilo razkritih nobenih pomembnih povezav med temi različicami in DN.

Pomembnost presejanja za variante je poudarjena z identifikacijo treh novih variant v tej študiji z MAF> 10%, katerega je Stata izbrala kot htSNP (tabela 1). Poleg tega je primerjava s HapMap (//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/ dostopen 23. novembra 2009) pokazala, da so bili podatki o genotipu na voljo samo za 40% variant CCL5 in 6% variant CCR5, ki so bile raziskane v tej študiji (tabela 1). To krepi vrednost resekcioniranja za obsežno študijo vseh pogostih različic gena CCR5 .

Ta študija je preučila pogoste različice CCL5 in CCR5 pri irski diabetični populaciji tipa 1 in ni pokazala statistično pomembne povezanosti z DN. Kljub dokazom o povezanosti med posamezno izbranimi različicami in DN pri primarno populaciji diabetikov tipa Japonske in Indije 2, tega v naši kavkaški zbirki sladkornih bolnikov tipa 1 ni bilo mogoče potrditi. To lahko odraža različno genetsko ozadje različnih etničnih in bolezenskih skupin.

Naši rezultati kažejo, da običajne različice CCL5 in CCR5 ne vplivajo močno na genetsko občutljivost DN pri kavkaških ljudeh s sladkorno boleznijo tipa 1.

Pridružitve

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NCBI35: 17: 31217613: 31236490: 1
  • NCBI35: 3: 46381637: 46396695: 1

Dodatne informacije

Slikovne datoteke

  1. 1.

    Dopolnilna slika 1 (i)

  2. 2

    Dopolnilna slika 1 (ii)

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopolnilna slika 2

  2. 2

    Dopolnilna tabela 1

    Dodatne informacije spremljajo prispevek na spletni strani Journal of Human Genetics (//www.nature.com/jhg)