Mutacijski spekter gena fenilalanin hidroksilaze (pah) in pripadajoči haplotipi razkrivajo etnično heterogenost v tajvanski populaciji | časopis za človeško genetiko

Mutacijski spekter gena fenilalanin hidroksilaze (pah) in pripadajoči haplotipi razkrivajo etnično heterogenost v tajvanski populaciji | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Haplotipi
  • Presnovne motnje
  • Mutacija
  • Populacijska genetika

Izvleček

Pomanjkanje fenilalanin hidroksilaze (PAH) je odgovorno za večino primerov fenilketonurije (PKU). V tej raziskavi mutacijskega spektra PAH pri tajvanski populaciji je bilo ugotovljenih 139 alelov, vključno s 34 različnimi mutacijami. V tej študiji so prvič poročali o mutacijah V190G, Q267R in F392I. Najpogostejše mutacije, R241C, R408Q in Ex6-96A> G, predstavljajo 23, 2%, 12, 0% in 9, 2%, mutantnih alelov. Haplotip analiza kaže, da sta R241C in Ex6-96A> G povezana izključno s haplotipom 4.3, da bi predlagali učinke ustanovitelja. Po drugi strani najdemo R408Q na dveh različnih haplotipih, ki nakazujeta na ponavljajoče se mutacije. Spekter mutacij PAH v Tajvanu kaže različne povezave s tistimi iz drugih azijskih regij, vendar obstajajo izjemne razlike. Zlasti so R408Q, E286K in −4173_ − 407del, ki predstavljajo 21% vseh mutantnih alelov na Tajvanu, zelo redki ali pa so med kohorti PKU iz drugih azijskih regij zelo zaznani, da bi predlagali učinke lokalnih ustanoviteljev. Poleg tega nizka vrednost homozigosti 0, 092 kaže na visoko stopnjo etnične heterogenosti med tajvanskim prebivalstvom. Naša raziskava mutacijskega spektra PAH in pripadajočih haplotipov je koristna za kasnejšo študijo o izvoru in migracijskem vzorcu prek Tajvana, otoka na zgodovinskem križišču migracije starodavnih populacij.

Uvod

Fenilketonurija (PKU; MIM # 261600) je genetska motnja, ki je posledica pomanjkanja fenilalanin hidroksilaze (PAH). Do danes so poročali o več kot 500 mutacijah PAH (spletna baza podatkov o PAH, //www.pahdb.mcgill.ca/). Te mutacije se razlikujejo glede na njihov vpliv na encimsko aktivnost PAH, ki vodi do niza kliničnih fenotipov, od hude PKU do blage hiperfenilalaninemije (MHP). Spekter mutacij PAH je bil raziskan po vsem svetu in ugotovljena je bila široka povezava kliničnih fenotipov z mutacijskimi genotipi. 1 Poleg tega so v loku PAH poročali o različnih vrstah polimorfnih tvorcev, vključno z enukleotidnim polimorfizmom (SNP), spremenljivim motivom ponovitev v tandemu (VNTR) in polimorfizmom s kratkimi ponovitvami v tandemu (STRs) (spletna baza podatkov o PAH, // www .pahdb.mcgill.ca /). Prevladujoča mutacija PAH na območju se ponavadi kaže kot ustanovna mutacija, ki se močno povezuje s posebnim polimorfnim haplotipom2, ki se uporablja za razumevanje porekla in vzorcev migracij prebivalstva. 3, 4, 5 Poleg tega je bilo ugotovljeno, da je število identificiranih različnih mutacij PAH odražalo etnično zapletenost v populaciji. 6

Današnji prebivalci Tajvana prihajajo iz različnih krajev. 7, 8 Poleg avstronezijskih staroselcev, ki so se pred več tisoč leti naselili na Tajvanu, so bili v zadnjih nekaj stoletjih tudi potomci z jugovzhodne obale Kitajske in novejši priseljenci s celinske Kitajske po drugi svetovni vojni. Druge etnične skupine, kot so Španci, Nizozemci in Japonci, so v zadnjih 400 letih prebivali krajši čas. Chien et al. 9 poročalo o mutacijah PAH v 25 družinah s Tajvanom, ki imajo pomanjkanje PAH. Identificirali so 18 različnih mutacij PAH, med katerimi je mutacija R241C predstavljala 32% mutiranih kromosomov, za tajvansko populacijo pa naj bi predlagali mutacijo.

Da bi izboljšali zastopanost mutacij PAH na Tajvanu, smo v tej raziskavi razširili velikost vzorca na 71 nepovezanih družin PKU. Poleg mutacijskega spektra so preučevali polimorfne haplotipe, povezane s prevladujočimi mutacijami PAH .

Rezultati in razprava

Identifikacija mutacij PAH

Sekvence PAH DNA, ki vključujejo ojačevalec, promotor, 13 eksonov in bočne spojnice eksona-intra, so bile določene s sekvenciranjem PCR-amplificiranih genskih DNK iz poskusov 71 nepovezanih družin PKU. Mutacije so bile ugotovljene na obeh alelih v 68 družinah in samo na enem alelu v 3 družinah. Tako so bile ugotovljene mutacije v 139 od 142 mutantnih kromosomov PAH , stopnja odkrivanja 98%. Mutacije predstavljajo 34 različnih vrst, vključno z 20 mutacijami missense, 4 nesmiselnimi mutacijami, 4 brisanjem / vstavitvijo znotraj strukturnega gena, 1 delecijo v izboljševalnem območju in 5, ki vplivajo na spajanje (tabela 1). Najpogostejše mutacije na Tajvanu so R241C, R408Q in Ex6-96A> G, ki predstavljajo 23, 2%, 12, 0% in 9, 2% od 142 mutantnih kromosomov. 17 mutacij so našli le enkrat.

Tabela polne velikosti

Funkcionalna analiza novih mutacij PAH

V tej študiji so pri tajvanski populaciji našli tri predhodno neprijavljene spremembe, V190G, Q267R in F392I. Za dostop do funkcionalnega pomena, povezanega s takšnimi spremembami, je bila preučena preostala aktivnost PAH iz celic COS-1, ki so bile okužene s pripadajočim plazmidom ekspresije PAH cDNA (slika 1). Rezultati so pokazali, da je aktivnost PAH, izražena iz sekvenc PAH, ki vsebujejo V190G ali Q267R, nižja od 2% stopnje encimske aktivnosti divjega tipa, kar kaže, da bi te spremembe lahko povzročile močan fenotip. Bolniki, ki imajo mutacijo V190G v funkcionalno hemisigoznem stanju (V190G / E228X), so pokazali klasični fenotip PKU (tabela 2, genotip 6). Prav tako je bolnik, ki je prenašal sestavljeno heterorozno mutacijo Q267R / G257V, manifestiral klasični fenotip PKU (tabela 2, genotip 20). Po drugi strani je PAH, izražen iz alela F392I, pokazal približno polovico aktivnosti divjega tipa, ko smo ga analizirali s sintetičnim kofaktorjem 6MPH 4 (slika 1a, desna plošča), medtem ko dosežemo raven divjega tipa, ko smo ga preizkusili z naravnim kofaktorjem BH 4 (slika 1a, levi panel).

Image

Učinki mutacij PAH na encimske aktivnosti PAH. Ekspresijski plazmid PAH cDNA, ki ima določeno substitucijo, je bil transficiran na celice COS-1. Stalne količine surovega ekstrakta iz okuženih celic so alikvotirane za določanje encimskih aktivnosti PAH z uporabo BH 4 ( a, levi panel in b ) ali 6MPH 4 ( a, desna plošča) kot kofaktor. Substrat L - [ 14 C] fenilalanin (Phe) in produkt L - [ 14 C] tirozin (Tyr) sta bila ločena na TLC plošči in vizualizirana z uporabo PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, ZDA). Encimske aktivnosti PAH so bile izračunane kot cpm L - [ 14 C] tirozina / (cpm L - [ 14 C] fenilalanina + cpm L - [ 14 C] tirozina), pri čemer je bila mutantna encimska aktivnost izražena kot odstotek tega divje vrste (WT). Mutacije so označene na vrhu. cDNA, komplementarna DNA; PAH, fenilalanin hidroksilaza.

Slika v polni velikosti

Tabela polne velikosti

Poleg tega, da je kodno zaporedje, je dokazano, da eksoni vsebujejo cis- regulacijske elemente, pomembne za prepoznavanje eksona med spajkanjem pred mRNA. 17 Dejansko smo pokazali, da približno ena četrtina naravno prisotnih mutacij na človeškem PAH eksonu 9 vpliva na predelavo RNA. 16 Prav tako smo ugotovili, da tiha mutacija V399V (c.1197A> T) vpliva na ojačevalni element eksona, ki povzroči, da ekson 11 preskoči med spajkanjem pred mRNA. 18 Za oceno, ali sprememba F392I (c.1174T> A) vpliva na prepoznavanje eksona 11 PAH , je bila izvedena študija, podobna raziskavi V399V (c.1197A> T). Niso bili najdeni pomembni učinki takšne spremembe na spajanje pred mRNA (podatki niso prikazani). Klinična manifestacija bolnikov, ki so nosili alel F392I, je bila MHP (tabela 2, genotip 40, F392I / R408Q in genotip 41, F392I /?). Ker je bil alel PAH pri teh dveh bolnikih bodisi blaga mutacija R408Q bodisi neznana identiteta, je bilo težko dodeliti fenotip F392I dokončno. Treba je omeniti, da pri teh dveh bolnikih ni bilo mogoče identificirati nobenih drugih mutacij v območju kodiranja gena PAH in med 108 pregledanimi kontrolnimi aleli ni bilo nobene substitucije F392I (c.1174T> A) (podatki niso prikazani), kar kaže, da substitucija morda ni nevtralen polimorfizem, temveč blaga mutacija PAH .

Nadaljnja funkcionalna analiza izbranih mutacij PAH

Za preučevanje razmerja med genotipom in kliničnim fenotipom mutacij PAH je bilo pomembno poznavanje preostale aktivnosti mutantnega gena. V tem vidiku je nukleotidna sprememba, za katero se predvideva, da bo popolnoma ukinila aktivnost PAH, to je nesmiselne mutacije in mutacije premika okvirja, in mutacije na mestu spajkanja tako na 5 'kot na 3' koncu intra, štejejo kot nične. Ničelna v genski aktivnosti se šteje tudi delecija −4173_-407del v ojačevalnem območju PAH, za katero je bilo dokazano, da močno poslabša transkripcijsko aktivnost jeter PAH . 11

Za izboljšanje natančne dodelitve mutacijskih fenotipov je bilo za analizo in vitro aktivnosti izbranih več mutacij. Najprej so bile določene preostale encimske aktivnosti v nizu mutacij missense v transficiranih celicah COS-1 (slika 1b) in določene so bile njihove relativne aktivnosti (RA), to je odstotek aktivnosti in vitro glede na kontrolo divjega tipa. (Tabela 2). Opozoriti je treba, da preostale encimske aktivnosti R261Q, P314T, R408Q in R408W v tej študiji niso bile preskušene, temveč so bile vzete iz objavljenih poročil. 16, 19, 20, 21 Ugotovili smo, da se lahko in vitro aktivnosti encimov, ki so povezane z mutacijami, precej razlikujejo od objavljenih poročil. Na primer, PAH protein, ki je nadomestil R241C, je v poročilu Okano in sod. Pokazal 25% preostale aktivnosti v COS celičnem ekspresijskem sistemu . 22 pa smo v tej raziskavi dobili mutantni rezultat 49%. V določeni meri je to lahko posledica spremenljive preostale aktivnosti mutantnega proteina, ki je odvisna od pogojev preizkusa, kot sta koncentracija substrata ali vrsta uporabljenih kofaktorjev. V zvezi s tem se je pokazalo, da se preostala aktivnost PAH, ki nosi F392I, močno razlikuje glede na to, ali smo uporabili kofaktor BH 4 ali 6MPH 4 (slika 1a). Zato naravnega stanja nekaterih mutantnih encimov morda ne bo mogoče natančno reproducirati in vitro .

Prav tako smo preučili, kako huda substitucija baze IVS7 + 5G> baze, ki spreminja zaporedje introna 7 zunaj dinukleotidov GT – AG, vpliva na spajanje pred mRNA. Celice COS-1 smo transficirali z modificiranim PAH cDNA ekspresijskim plazmidom, ki nosi zaporedje intrana 7 (slika 2a). Analiza severne blotke PAH RNA je pokazala, da je bil konstrukt, ki je nosil G-A substitucijo na petem nukleotidu introna 7 (IVS7 + 5G> A), popolnoma odpravljen; zaznan je bil le 3, 5-kb primarni prepis (slika 2b, proga 1). V nasprotju s tem bi lahko pravilno zapleteno mRNA velikosti 2, 4 kb poleg 3, 5-kb primarnega prepisa zaznali, če bi uporabili konstrukt, ki nosi zaporedje divjih vrst intronov (slika 2b, proga 2), kar kaže na to, da IVS7 + 5G> Nadomestitev močno poslabša spajanje pre-mRNA PAH in s tem encimsko aktivnost PAH (slika 2c, proga 1). Tako je mutacija IVS7 + 5G> A razvrščena kot nična. Ugotovljeno je, da substitucija baze IVS7 + 5G> z bazo ne vključuje invariantnih dinukleotidov GT na mestu darovalca, vendar pa takšna substitucija močno vpliva na spajanje pred mRNA. To je lahko zato, ker je zaporedje darovalca spajkanja introna 7 "šibko" (CC / GTGAGT, kjer poševnica "/" označuje mejo eksona-introna), ker ustreza le šestim osnovam konsenzusnega zaporedja osem baz (AG / GTRAGT, kjer je R = purin). V takšni konfiguraciji lahko sprememba baze v konsenzusnem zaporedju privede do skoraj popolne ukinitve spajanja pred-mRNA. 23

Image

Učinki PAH IVS7 + 5G> Mutacija na aktivnost PAH. ( a ) Shematski prikaz plazmida ekspresije PAH pod transkripcijskim nadzorom promotorja SV40 (SV) in signala poliadenilacije (pA). Upognjena puščica označuje začetno mesto za transkripcijo. PAH zaporedje vključuje eksone 1 do 13 in intron 7 (Int 7); nukleotidne sekvence, ki obdajajo 5-spajkalno stičišče introna 7, so prikazane z malimi črkami, ki predstavljajo zaporedje introna. Poudarjena je IVS7 + 5G> mutacija, ki nosi mutacijo nt 5 v intronu 7. ( b ) Analiza severnega blota. Skupna RNA, izolirana iz celic COS-1, transficirana z ekspresijskim plazmidom PAH z intronom 7, ki nosi mutacijo IVS7 nt 5 (IVS + 5G> A) (pas 1), intron 7, ki nosi zaporedje divjih vrst (WT), zaporedje 2, netransficirano kontrolo COS-1 (steza 3) ali cDNA divjega tipa PAH (proga 4) smo hibridizirali s P 32- sondo PAD cDNA (zgornja plošča) in nato po odstranjevanju sonde GAPDH cDNA (spodnja plošča). Navedene so nerazrezane in zlepljene PAH mRNA. ( c ) Test encimskih aktivnosti PAH. Stalne količine surovega ekstrakta iz transficiranih celic s COS-1 so alikvotirane za določanje encimskih aktivnosti PAH z uporabo 6MPH 4 kot kofaktorja. Substrat L - [ 14 C] fenilalanin (Phe) in produkt L - [ 14 C] tirozin (Tyr) sta bila ločena na TLC plošči in vizualizirana z uporabo PhosphorImager. Vzorci na vsakem pasu so kot na pasu 1–3 v ( b ). cDNA, komplementarna DNA; PAH, fenilalanin hidroksilaza.

Slika v polni velikosti

Povezava genotipa mutacije s kliničnim fenotipom

Identificirane 34 različne mutacije PAH so v 71 proučevanih družinah PKU različno združene v 50 genotipov (tabela 2). Homozigotne mutacije so bile ugotovljene v 10 družinah, ki so opazovale pogostost homoalleličnih genotipov PKU 14% (tabela 2, genotipi 1–4). Na podlagi predhodno obdelane koncentracije fenilalanina v plazmi, ki je bila vzeta tudi kot referenca na podatke o toleranci na fenilalanin, so bili določeni trije klinični fenotipi, to je klasični PKU, blag PKU in MHP. 1, 6 Med 71 družinami PKU je bilo 22 dodeljenih klasičnemu PKU, 26 do blage PKU in 19 MHP, medtem ko 4 družine niso bile dodeljene zaradi pomanjkanja zadostnih kliničnih podatkov (tabela 2). V naši skupini PKU so ugotovili, da bolniki z enakim mutacijskim genotipom večinoma spadajo v eno klinično kategorijo; izjema je bil genotip E286K / R241C, ki je bil dodeljen kategorijama blage PKU in MHP (tabela 2, genotip 26). Kljub temu je potrebnih več primerov za trdno vzpostavitev take povezave, zlasti kadar se je v enem primeru pojavilo veliko genotipov.

Ugotovljeno je, da je bilo ugotovljeno, da številne mutacije, čeprav so se pokazale velike in vitro aktivnosti, kažejo na hude klinične fenotipe. Kot primer, PAH, ki je nadomeščal R243Q, je pokazal 13% preostale encimske aktivnosti v naši raziskavi ali 10% v študiji Okano et al. 22 Kljub temu se zdi, da je ta mutacija povezana s hudim fenotipom, ki je posledica njegovega homozigotnega stanja (tabela 2, genotip 3) ali funkcionalno hemisigoznega stanja (tabela 2, genotipa 10 in 30). Prav tako so se pokazale znatne encimske aktivnosti za R297H in R261Q, vendar pa so pri bolnikih, ki so prenašali ta alel, pokazali hud klinični fenotip (Tabela 2, genotip 31, R297H / R413P in genotip 35, R261Q /?). Omeniti velja, da so bili bolniki, ki so prenašali R261Q ali R297H, identificirani že v najstniškem obdobju, ko so se pojavili simptomi duševne zaostalosti. Za ponovno oceno dodeljevanja fenotipov je potrebnih več raziskav, kot je merjenje njihove stopnje fenilalanin. Zlasti je bilo ugotovljeno, da je bila mutacija R297H v funkcionalnem hemisigoznem stanju v poljski skupini PKU povezana s fenotipom MHP. 24 Predvideti bi lahko, da če mutantni protein kaže kinetično nestabilnost, se lahko protein in vitro stabilizira, če substrati ali kofaktorji presegajo fiziološke koncentracije. Zato je za boljšo povezavo med aktivnostmi preostalih encimov in klinično resnostjo morda potrebna podrobna biokemična karakterizacija, kot so določitve specifične aktivnosti, aktivacija substrata, encimska kinetika in stabilnost mutantnih PAH proteinov. 25, 26

Na podlagi fenotipa pacienta in podatkov študije ekspresije in vitro smo dodelili fenotip mutacije PAH (tabela 1). Med 34 mutacijami je bilo 23 dodeljenih klasičnemu PKU, od 2 do blage PKU, 5 do MHP in 4, in sicer je S70del, R261Q, R297H in V388M ostalo še dodeliti. Opaženo je, da so pri študiji Song et al. Bolniki pokazali klasični fenotip PKU, ko so mutacije S70del in R261Q v funkcionalno hemisizem stanju ali R261Q v homozigotnem stanju . 27 Zato sta verjetno S70del in R261Q povezana s hudim fenotipom PKU. Kar zadeva mutacijo V388M, je mutirani protein pokazal 18% normalne encimske aktivnosti pri našem delu (slika 1b) v soglasju s 15% mutanta v študiji Okano et al. , 22, kar je znano kot kinetična varianta. 28 bolnikov s PKU na Japonskem in v Koreji, ki so v funkcionalno hemisigoznem stanju nosili V388M, je pokazalo klasični PKU. 29, 30, 31 Tako je mutacija V388M najverjetneje povezana s hudim fenotipom. Skladno s tem smo pri enem bolniku, ki je nosil sestavljeno heterorozno mutacijo V388M / R241C (tabela 2, genotip 45), opazili blag fenotip PKU. Poleg tega smo med primerjanjem fenotipov mutacije PAH med orientalskimi PKU kohortami 22, 27, 29, 30, 31 našli dobro soglasje med razpoložljivimi mutacijami, razen tistih, ki jih je imel R241C. Ugotovljeno je bilo, da je bila mutacija R241C povezana z blagim fenotipom PKU v naši skupini, pa tudi s Korejo in Japonsko. 29, 30, 31 Vendar na Kitajskem, kot so preučevali Song et al. , Pri 27 bolnikih, ki so mutirali spojino heterozygote mutacijo R241C / R243Q, ali z MHP pri enem bolniku s spojino mutacije heterozygote R241C / V399V, je pri R241C prišlo do blage PKU. Možno je, da se lahko klinični fenotip R241C razlikuje glede na preostalo aktivnost pridruženega alela, če je prisoten v skoraj funkcionalnem hemisigoznem stanju. Ugotovljeno je, da nobeden od bolnikov iz te študije in iz Koreje in Japonske ni imel genotipa R241C / V399V. Če povzamemo, med mutacijami PAH, ugotovljenimi v tej raziskavi, je najvišji delež zasedel klasični tip PKU (23 od 31 mutacij, 74%), vendar je več kot 60% družin s pomanjkanjem PAH (45 od 67 družin) pripadalo blažje oblike verjetno posledica dejstva, da najpogostejše mutacije R241C in R408Q spadajo med blage oblike pomanjkanja PAH.

Po drugi strani pa Guldberg et al. 1 so vzpostavili sistem za napovedovanje presnovnega fenotipa na osnovi genotipa s pomočjo skupine PKU v Evropi. Vsakemu od 105 mutacij PAH so dodelili dodeljeno vrednost (AV) enemu od štirih fenotipskih razredov, to je hudo PKU (AV = 1), zmerno PKU (AV = 2), blag PKU (AV = 4) in MHP (AV = 8), ki temeljijo na fenotipih mutacij PAH v povezavi s funkcionalno hemisigoznim stanjem. Ti avtorji so nadalje dokazali, da se v večini preučenih primerov fenotipske učinke dveh mutantnih alelov PAH lahko določi s seštevkom njihovih AV-jev: klasični PKU, AV = 2; zmerna PKU, AV = 3; zmerna / blaga PKU, AV = 4; blag PKU, AV = 5–6; blag PKU / MHP, AV = 8; in MHP, AV = 9-16. Da bi preučili, ali je tak sistem veljaven v naši skupini PKU, fenotipizirajo dodelitev mutacij PAH Guldberg in sod. , 1, če je na voljo, je vključeno v tabelo 2. Rezultati so pokazali, da se opaženi klinični fenotip ujema z napovedanim fenotipom pri bolnikih, razen tistih, ki nosijo alele EX6-96A> G in R241C (tabela 2). EX6-96A> G sta Guldberg et al. Določila kot zmerno PKU . , 1 pacienti homozigoti (Tabela 2, genotip 1) ali funkcionalno hemizigotični za EX-96A> G (tabela 2, genotipa 18 in 19) so v naši skupini kazali klasični fenotip PKU kot pri bolnikih iz Kitajske, Koreje in Japonske. 27, 29, 30, 31 Prav tako so Guldberg idr. Dodelili R241C, najpogostejše mutacije na Tajvanu . 1 kot MHP. Vendar je večina naših bolnikov v ali skoraj funkcionalno hemisigoznem stanju R241C (tabela 2, genotipi 12, 13, 24, 25 in 42) spadala v kategorijo blagih PKU. Mutacije EX6-96A> G in R241C prevladujejo med orientalsko populacijo, 22, 27, 29, 30, 31, 32, vendar so v evropski populaciji redke. 1 Dodelitev EX6-96A> G in R241C Guldberg et al. 1 je bil narejen iz samo enega alela pri bolniku s PKU, kar je verjetno povzročilo neskladje zaradi majhnega števila bolnikov, ki se analizirajo. Možno je tudi, da mutacija R241C lahko manifestira MHP ali blag PKU fenotip, odvisen od pridruženega alela, kot je prikazano v študiji Song in sod. 27 Tako je bilo pri večini preučenih mutacij PKU dober dogovor o dodelitvi fenotipa ne le v orientalski skupini PKU, temveč tudi v belcih, kar kaže, da resnost bolezni določa predvsem genotip PAH, kot so predlagali tudi drugi študije. 1, 22

Genska raznolikost običajnih mutacij PAH na Tajvanu

V tej študiji so bile na Tajvanu najpogostejše mutacije R241C, R408Q in EX6-96A> G, ki predstavljajo 23, 2%, 12, 0% in 9, 2% mutantnih kromosomov (tabela 1). Za preučitev, ali je bila njihova razširjenost posledica obogatitve zaradi učinka ustanovitelja ali posledica ponavljajočih se mutacij, so bili povezani haplotipi teh mutantnih alelov določeni z analizo RFLP, VNTR, STR in sedmih intragenih markerjev SNP (tabela 3).

Tabela polne velikosti

Mutacija R241C, ki vključuje dinukleotid CpG, je lahko vroča točka. Med 33 kromosomi, ki vsebujejo R241C, je bilo ugotovljeno, da so vsi povezani s haplotipom RFLP 4 (tabela 3), glavnim haplotipom tako divjega tipa kot mutantnih alelov na Tajvanu. 10 Ugotovljeno je bilo, da je ta haplotip povezan s trikratnim VNTR (VNTR 3) s zaporedjem kaset a2-b2-c1, označenim kot haplotip 4.3. 33 Za R241C smo opazili odstopanja v povezavi s številko STR, vključno s 234, 238 in 242, z unimodalno porazdelitvijo, osredotočeno na alel 238 (tabela 3). V nasprotju s tem je bila večja raznolikost alelnosti STR ugotovljena pri 49 preučenih alelih divjih tipov RFLP haplotipa 4.3, kjer je variacija STR pokazala široko porazdelitev unimodel z 238 in 242 aleli pri primerljivih frekvencah (35% v primerjavi z 49%) (tabela 3) . Študija Chien et al. 9 so ugotovili, da je R241C najpogostejša mutacija PAH na Tajvanu, kar kaže na močan učinek ustanovitelja. V naših študijah haplotipa RFLP, konfiguracije VNTR in vzorca SNPs smo pokazali, da so vsi aleli R241C ( n = 33) padli v isto kromosomsko ozadje PAH, da bi potrdili, da so po sestoju enaki (tabela 3). Opažene pa so bile razlike v porazdelitvi alelov STR (tabela 3). Lokusi STR se hitro razvijajo in dokazano imajo visoke stopnje mutacije. 34 Povezava mutacije R241C s kromosomi različnih številk STR kaže na to, da se je R241C pojavil precej zgodaj v populacijski zgodovini. Kljub temu ne moremo izključiti, da se je R241C pojavil neodvisno v tem kromosomskem ozadju, zlasti kadar je haplotip 4 najpogostejši haplotip med Kitajci. 10 Alel R241C najdemo tudi na Kitajskem, v Koreji in na Japonskem s prijavljenimi frekvencami 3, 7%, 5, 7% in 10, 1%. 30, 31, 32 Zanimivo bi bilo proučiti njihove povezane haplotipe in raziskati, ali izvirajo od istega ustanovitelja.

Poročalo se je, da je R408Q, ki predstavlja 12% mutantnih alelov na Tajvanu, v neravnovesju povezave s haplotipom PAH RFLP 4. 35 Zanimivo je, da je bilo v naši skupini PKU 2 od skupno 17 preiskovanih alelov R408Q povezanih z VNTR od pet ponovitev (VNTR 5) zaporedja kaset (a1) 3 -b5-c1 (tabela 3). Za haplotip RFLP tega alela je bilo ugotovljeno, da je haplotip 11 ali 34, odvisno od stanja zaporedja prepoznavanja EcoRV, ki ga ni mogoče analizirati s trenutno metodo, ki temelji na PCR. Genotip intragenih markerjev SNP, vključno s štirimi v intronih IVS2 + 19T / C, IVS3−22T / C, IVS4 + 47C / T in IVS10 + 97A / G, in trije v eksonih c.696G / A (Q232Q), c.735A / G (V245V) in c.1155G / C (L385L) smo določili s sekvenciranjem genomske DNK, ki je ojačana s PCR. Ugotovljene so bile bistvene razlike SNP med aleli R408Q, povezanimi z VNTR 3 in VNTR 5 (tabela 3). Očitno je mutacija R408Q, ki se je pojavila na dveh kromosomskih ozadjih, najverjetneje posledica ponavljajočih se mutacij. V nasprotju s tem se mutacija EX6-96A> G, ki je bila povezana s haplotipom RFLP 4.3, pojavlja v enem samem haplotipu SNP s STR 242 in verjetno izvira iz mutacije ustanovitelja (tabela 3). Čeprav je bilo ugotovljeno, da je glavni alel R408Q povezan s kromosomom RFLP haplotipa 4.3, podoben vzorcem R241C in EX6-96A> G, so vzorci SNP R408Q pri IVS3-22 in IVS4 + 47 različni (tabela 3). R408Q je edina mutacija, povezana z manjšim podtipom RFLP haplotipa 4.3.

Etnična heterogenost v tajvanskem prebivalstvu

Med 34 identificiranimi različnimi mutacijami PAH je devet mutacij R241C, R408Q, EX6-96A> G, E286K, R413P, R243Q, −4173_ − 407del, R111X in V399V, ki predstavljajo 70% vseh mutantnih alelov. 3% ali več in veljajo za razširjene. Med njimi se med orientalci štejejo tudi R241C, EX6-96A> G, R413P, R243Q in R111X, medtem ko V399V pri kitajski populaciji Han doseže relativno 3, 2%. 32 Preostale mutacije, R408Q (12, 0%), E286K (5, 6%) in -4173_-407del (3, 5%), ki predstavljajo 21% vseh mutantnih alelov na Tajvanu, so zelo redke ali neopažene med skupinami Kitajcev, Korejcev PKU in japonski, 22, 27, 29, 30, 31, 32, ki kažejo na učinke lokalnih ustanoviteljev. Zato mutacijski spekter PAH v Tajvanu kaže izjemne razlike, kljub temu da ima različne povezave z drugimi azijskimi regijami.

Po drugi strani je mutacija R408W, najpogostejša evropska mutacija PKU, redka med PKU bolniki kitajskih, korejskih in japonskih etničnih skupin, 22, 27, 29, 30, 31, 32, vendar R408W predstavlja 2, 8% mutantnih alelov ( n = 4) na Tajvanu. Zlasti je bilo ugotovljeno, da je ta alel povezan s haplotipom 44 ( n = 2), 41 ( n = 1) in 4 ( n = 1). 35, 36 Visoke ponavljajoče se hitrosti R408Q (c.1223G> A) in R408W (c.1222C> T) pripisujejo metilaciji dinukleotida CpG v CpG. T) v človeškem genu PAH. Hum. Mutat. 27, 975 (2006). "Href =" / Članki / jhg2013136 # ref37 "aria-label =" Referenca 37 "> 37 Povezava alelov R408Q in R408W z različnimi haplotipi podpira kompleksnost splošne populacije na Tajvanu. po drugi strani je bila vrednost indikatorja homozigosti na lokusu PAH v določeni populaciji (določena z j = Σ x i 2 , kjer je x i frekvenca i . alela) uporabljena kot indikator populacijske heterogenosti. na Tajvanskem izračunano na 0, 092, kar je v kitajski vrednosti primerljivo z vrednostjo 0, 089. 32 Tako nizka vrednost podpira visoko stopnjo etnične heterogenosti tajvanskega prebivalstva. V tem pogledu Lin in drugi 38, ki temeljijo na študiji HLA, je pokazal, da so glavni etnični sestavni deli prebivalstva Tajvana, to sta Minnan in Hakka, predvsem potomci plemenskih skupin jugovzhodne obale Kitajske z obsežnimi zakonskimi zvezami do domorodnih Tajvanov, zato so poleg skupne dediščine med Kitajci Han in Tajvansko prebivalstvo, naša ugotovitev podpira idejo o edinstvenem izvornem izvoru prebivalcev Tajvana. 38

Zaključne opombe

Tajvan, majhen otok, je bil na presečišču gibanja prebivalstva. 7, 8 Raziskave, ki temeljijo na preučevanju genetskih variacij bakterij v črevesju človeka Helicobacter pylori in na jezikovnih dokazih, kažejo, da je večina pacifiških populacij izvirala iz Tajvana ∼ pred 5000 leti. 39, 40 Vendar pa so s preučevanjem genetskega podpisa na mitohondrijski DNK Soares in sod. 41 ugotovil, da so se polinezijci morda razširili na Tihi ocean preko Nove Gvineje, ne pa preko Tajvana, kot se je prej mislilo. V tem delu smo pokazali, da ima tajvansko prebivalstvo edinstven spekter mutacij PAH . Nadaljnje proučevanje mutacijskega spektra PAH v pacifiških populacijah bi bilo koristno, da bi razjasnili njihov izvor in vzorec migracije glede na Tajvan.