Začetno sekvenciranje genoma in analiza multiplih mielomov | naravo

Začetno sekvenciranje genoma in analiza multiplih mielomov | naravo

Anonim

Predmeti

  • Rak genetika
  • Mieloma
  • Zaporedje

Izvleček

Multipni mielom je neozdravljiva malignost plazemskih celic, njegova patogeneza pa je slabo razumljena. Tu poročamo o množičnem vzporednem zaporedju 38 tumorskih genomov in njihovi primerjavi z ujemajočimi se normalnimi DNK. Vzorec somatske mutacije v naboru podatkov je bil predlagan več novih in nepričakovanih onkogenih mehanizmov. Sem spadajo mutacije genov, ki sodelujejo pri prevajanju beljakovin (opaženi pri skoraj polovici bolnikov), geni, ki sodelujejo pri metilaciji histona, in geni, ki sodelujejo pri strjevanju krvi. Poleg tega so mutacije pri 11 članih poti NF-κB pokazale širšo od pričakovane vloge signalizacije NF-κB. Pri potencialnem takojšnjem kliničnem pomenu so pri 4% bolnikov opazili aktiviranje mutacij kinazne BRAF, kar kaže na oceno zaviralcev BRAF v kliničnih preskušanjih z mielomi. Ti rezultati kažejo, da bo sekvenca velikih zbirk vzorcev genoma raka dala nove vpoglede v raka, ki jih obstoječe znanje ne predvideva.

Glavno

Multipni mielom je neozdravljiva malignost zrelih B-limfoidnih celic, njegova patogeneza pa je le delno razumljiva. Približno 40% primerov pretoči kromosomske translokacije, kar povzroči prekomerno ekspresijo genov (vključno s CCND1 , CCND3 , MAF , MAFB , WHSC1 (imenovanim tudi MMSET ) in FGFR3 ), in sicer tako, da se izločijo v lokus 1 teške verige imunoglobulinov (IgH). Drugi primeri kažejo hiperdiploidijo. Vendar pa te nepravilnosti verjetno niso dovolj za maligno transformacijo, ker jih opažamo tudi pri predmalignem sindromu, znanem kot monoklonska gamapatija negotovega pomena. Maligni progresivni dogodki vključujejo aktiviranje MYC , FGFR3 , KRAS in NRAS in aktiviranje poti NF-κB 1, 2, 3 . V zadnjem času so poročali tudi o mutacijah izgube funkcije v histonski demetilazi UTX (imenovani tudi KDM6A ) 4 .

Zmogljiv način za razumevanje molekularne osnove raka je sekvenciranje celotnega genoma ali proteina, ki kodira beljakovine, primerjava tumorja z normalnim pri istem pacientu za prepoznavanje pridobljenih somatskih mutacij. Nedavna poročila so opisala zaporedje celih genomov pri enem samem bolniku 5, 6, 7, 8, 9 . Čeprav so informativne narave, smo domnevali, da bi večje število primerov omogočilo identifikacijo biološko pomembnih vzorcev, ki sicer ne bi bili razvidni.

Krajina več mutacij mieloma

Študirali smo 38 bolnikov z multiplim mielomom (dodatna tabela 1), pri katerih smo izvedli sekvenciranje celotnega genoma (WGS) za 23 bolnikov in celovito eksomecirano sekvenco (WES; ocena 164.687 eksonov) za 16 bolnikov, pri enem pacientu analizirali oba pristopa (dodatne informacije) . WES je stroškovno učinkovita strategija za prepoznavanje mutacij, ki kodirajo beljakovine, vendar ne more zaznati nekodiranih mutacij in preureditev. Mutacije, specifične za tumor, smo identificirali s primerjanjem vsakega tumorja z ustreznim normalnim z uporabo niza algoritmov, namenjenih zaznavanju točkovnih mutacij, majhnih vstavkov / izbrisov (indeklov) in drugih preureditev (dodatna slika 1). Na podlagi WGS je bila pogostost tumorsko specifičnih mutacij 2, 9 na milijon baz, kar ustreza približno 7.450 točkovnim mutacijam na vzorec v genomu, vključno s povprečno 35 mutirnimi spremembami aminokislin in 21 kromosomskimi preureditvami, ki motijo ​​protein -kodirajoča območja (dopolnilni tabeli 2 in 3). Ugotovljeno je bilo, da je algoritem za klicanje mutacij zelo natančen in ima resnično 95-odstotno pozitivno stopnjo pri točkovnih mutacijah (dopolnilno besedilo, dopolnilni tabeli 4 in 5 ter dodatna slika 2).

Hitrost mutacije v genomu se je močno razlikovala, odvisno od sestave baze, pri čemer so se mutacije na CpG dinukleotidih pojavile štirikrat pogosteje kot mutacije na A ali T bazah (dopolnilna slika 3a). Poleg tega je bila pogostost mutacij v kodirnih območjih tudi po korekciji bazne sestave nižja od tiste, ki so jo opazili v introničnih in intergenih regijah ( P <1 × 10 −16 ; dopolnilna slika 3b), kar je lahko posledica negativnega selektivnega tlaka zaradi motenj motenj kodiranje zaporedij. Manjša je tudi stopnja mutacije v introničnih regijah v primerjavi z intergenimi regijami ( P <1 × 10 −16 ), kar lahko odraža popravilo, povezano s transkripcijo, kot je bilo že predlagano 10, 11 . V skladu s to razlago smo opazili nižjo stopnjo mutacije v intronih genov, izraženih v multiplih mielomih, v primerjavi s tistimi, ki niso izraženi (slika 1a).

Image

a, hitrosti mutacije Intronic, razdeljene na hitrost ekspresije gena v multiplih mielomih. Stopnje izražanja genov so bile ocenjene glede na delež klicev Affymetrix Present (P) v 304 primarnih vzorcih z multiplim mielomom. Vrstice napak označujejo ± 1 standardni odklon. NS, ni pomembno. b, rezultati funkcionalne pomembnosti (FI) so bili ustvarjeni za vse točkovne mutacije in razdeljeni na porazdelitve za nepomembne mutacije (zgornji histogram; n = 1, 019) in pomembne mutacije (spodaj; n = 36). Primerjava porazdelitev poteka preko statistike Kolmogorov – Smirnov.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Pogosto mutirani geni

Naslednjič smo se osredotočili na distribucijo somatskih, tihih mutacij, ki kodirajo beljakovine. Ocenili smo statistično pomembnost v primerjavi s porazdelitvijo mutacij v ozadju (dopolnilne informacije). Deset genov je pokazalo statistično značilne hitrosti mutacije, ki spreminjajo beljakovine ("pomembno mutirani geni"), pri stopnji lažne odkritja (FDR) ≤0, 10 (tabela 1). Za raziskovanje njihovega funkcionalnega pomena smo primerjali njihovo predvideno posledico (na podlagi evolucijske ohranjenosti in narave spremembe aminokislin) s porazdelitvijo vseh kodirnih mutacij. Ta analiza je pokazala dramatično nagibanje rezultatov 12 (10) za deset močno mutiranih genov ( P = 7, 6 × 10 −14 ; Slika 1b), kar je podprlo njihovo biološko pomembnost. Tudi potem, ko so iz analize izključene mutacije RAS in p53, je nagibanje ostalo pomembno ( P <0, 01).

Tabela polne velikosti

Pregledali smo tudi stopnjo mutacije neimenovanih / sinonimnih (NS / S) občutno mutiranih genov. Pričakovano razmerje NS / S je bilo 2, 82 ± 0, 15, medtem ko je bilo opaženo razmerje 39: 0 za pomembne gene ( P <0, 0001), kar še okrepi primer, da so ti geni verjetno gonilci patogeneze multiplih mielomov in je malo verjetno, da preprosto biti mutacije potnikov.

Znatno mutirani geni vključujejo tri predhodno poročane o točkovnih mutacijah v multiplih mielomih : KRAS in NRAS (10 in 9 primerov (50%), P <1 × 10 −11, q <1 × 10 −6 ) in TP53 (3 primeri (8%), P = 5, 1 × 10 −6, q = 0, 019). Zanimivo je, da smo identificirali dve točkovni mutaciji (5%, P = 0, 000027, q = 0, 086) v CCND1 (ciklin D1), ki je že dolgo prepoznan kot tarča kromosomske translokacije v multiplih mielomih, vendar pri katerih točkovnih mutacij nismo opazili. prej pri raku.

Za preostalih šest genov zaenkrat še ni bilo znano, da sodelujejo v raku, in kažejo na nove vidike patogeneze multiplaga mieloma.

Mutacija RNA in mutacije proteinske homeostaze

Presenetljiva ugotovitev te študije je bila odkritje pogostih mutacij v genih, ki sodelujejo pri predelavi RNA, prevajanju beljakovin in nerazvitem proteinskemu odzivu. Takšne mutacije so opazili pri skoraj polovici bolnikov.

Gen DIS3 (imenovan tudi RRP44 ) je mutiral pri 4 od 38 bolnikov (11%, P = 2, 4 × 10 -6, q = 0, 011). DIS3 kodira visoko ohranjeno RNK eksonukleazo, ki služi kot katalitična komponenta kompleksa eksozomov, ki sodeluje pri uravnavanju predelave in številčnosti vseh vrst RNA 13, 14 . Štiri opažene mutacije se pojavljajo na zelo ohranjenih območjih (slika 2a) in se grozdijo znotraj RNB domene, ki je obrnjena proti katalitičnemu žepu encima (slika 2b). Dve vrsti dokazov kažeta, da mutacije DIS3 povzročijo izgubo funkcije. Najprej so trije od štirih tumorjev z mutacijami pokazali izgubo heteroroznosti z brisanjem preostalega alela DIS3 . Drugič, dve mutaciji sta bili funkcionalno značilni za kvas in bakterije, zaradi česar izgublja encimsko aktivnost, kar vodi do kopičenja njihovih ciljev RNA 15, 16 . Glede na to, da je ključna vloga eksosoma uravnavanje razpoložljivega baze mRNK, ki so na voljo za prevod 17, ti rezultati kažejo, da lahko mutacije DIS3 disregulirajo translacijo beljakovin kot onkogeni mehanizem pri večkratnem mielomu.

Image

a, Poravnava humane, kvasovke in bakterijske RNB domene DIS3. Položaji opazovanih mutacij so označeni glede na človeško sekvenco. Ekvivalenti kvasa so S541, V568, G833 in R847. b, Enodimenzionalne in tridimenzionalne strukture kvasa DIS3, z RNB domeno obarvano v modri barvi in ​​mutacije obarvane v rdečo. c, GSEA graf, ki prikazuje obogatitev gena ribosomalnega proteina med geni, ki so v korelaciji z ekspresijo FAM46C v 414 vzorcih z multiplim mielomom.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Nadaljnja podpora vlogi translacijskega nadzora v patogenezi multiplega mieloma prihaja iz opazovanja mutacij v genu FAM46C pri 5 od 38 (13%) bolnikov ( P = 1, 8 × 10 −10, q = 1 × 10 −6 ). Ni objavljene funkcionalne opombe FAM46C in njeno zaporedje nima očitne homologije z znanimi proteini. Da bi dobili vpogled v njegovo celično vlogo, smo preučili njegov vzorec genske ekspresije v 414 vzorcih z več mielomi in ga primerjali z izražanjem 395 genskih nizov, izbranih v zbirki podatkov o molekularnih podpisih (MSigDB), z uporabo algoritma GSEA 18, 19, 20. Ekspresija FAM46C je bila močno povezana ( q = 0, 034 po korekciji več hipotez; slika 2c) z izražanjem niza ribosomalnih beljakovin, za katere je znano, da so tesno koregulirane 21 . Podobno so opazili močno povezanost z evkariontskimi iniciacijami in razteznimi faktorji, ki sodelujejo pri prevajanju beljakovin. Čeprav natančna funkcija FAM46C ostaja neznana, ta presenetljiva korelacija zagotavlja močan dokaz, da je FAM46C na nek način funkcionalno povezan s prevajanjem. V skladu s tem opažanjem je bilo nedavno dokazano, da FAM46C deluje kot faktor stabilnosti mRNA (predložen rokopis M. Fleming).

Čeprav niso same statistično pomembne, smo našli mutacije v petih drugih genih, povezanih s prevajanjem beljakovin, stabilnostjo in nerazvitimi odzivi na beljakovine (dopolnilna tabela 6), ki še naprej podpirajo vlogo translacijske kontrole pri multiplih mielomih. Zlasti zanimiva sta bila dva bolnika mutacije v razvitem gensko odzivnem proteinu XBP1 . Pokazalo se je, da prekomerna ekspresija določene zmesne oblike XBP1 pri miših povzroča multipli mieloma podoben sindrom, čeprav ni opisana nobena vloga XBP1 v patogenezi človeškega multipkega mieloma 22 .

Zaradi povezanega zanimanja so bile mutacije gena LRRK2 opažene pri 3 od 38 bolnikov (8%; dodatna tabela 6). LRRK2 kodira serin-treonin kinazo, ki fosforilira protein 4-vezavni protein (4EBP). LRRK2 je najbolj znan po svoji vlogi pri nagnjenju k Parkinsonovi bolezni 23, 24 . Za Parkinsonovo bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni, kot je Huntingtonova bolezen, so delno značilni tudi odklonjeni nerazviti odzivi na beljakovine 25 . Proteinska homeostaza je lahko še posebej pomembna pri multiplem mielomu zaradi ogromne hitrosti proizvodnje imunoglobulinov s celicami multiplih mielomov 26, 27, 28 . Ugotovitev je kliničnega pomena tudi zaradi uspešnosti zdravila bortezomib (Velcade), ki zavira proteasom in ki kaže izjemno aktivnost pri multiplem mielomu v primerjavi z drugimi vrstami tumorjev 29 .

Ti rezultati skupaj kažejo, da so mutacije, ki vplivajo na prevajanje beljakovin in homeostazo, izredno pogoste pri multiplem mielomu (vsaj 16 od 38 bolnikov; 42%), kar kaže na to, da je morda vredno raziskati dodatne terapevtske pristope, ki so usmerjeni v te mehanizme.

Identične mutacije kažejo na onkogene s povečano funkcijo

Drug način prepoznavanja biološko pomembnih mutacij je iskanje ponovitve enakih mutacij, ki kažejo na spremembe funkcije pri onkogenih. Dva bolnika sta imela identično mutacijo (K123R) v domeni, ki veže DNA, regulatornega faktorja IRF4 interferona. Zanimivo je, da je nedavno zaslon za interno delovanje RNA pri multiplem mielomu pokazal, da je IRF4 potreben za preživetje multiplih mielomov, kar je skladno z njegovo vlogo domnevnega onkogena 30 . Genotipizacija te mutacije pri 161 dodatnih vzorcih multiplih mielomov je identificirala še dva bolnika s to mutacijo. IRF4 je transkripcijski regulator PRDM1 (imenovan tudi BLIMP1), dva od 38 zaporednih pacientov sta prav tako izpostavila mutacije PRDM1 . PRDM1 je transkripcijski faktor, ki sodeluje pri diferenciaciji plazemskih celic, pri čemer se mutacije izgube funkcije pojavijo pri difuznem velikem B-celičnem limfomu 31, 32, 33, 34, 35 .

Klinično delujoče mutacije v BRAF

Nekatere mutacije si zaslužijo pozornost zaradi kliničnega pomena. Eden od osemindvajsetih bolnikov je mutiral mutacijo BRAF kinaze (G469A). Čeprav BRAF G469A pri multiplih mielomih že nismo opazili, je znano, da je ta natančna mutacija aktivirajoča in onkogena 36 . Za 12 najpogostejših mutacij BRAF smo ugotovili dodatnih 161 bolnikov z multiplim mielomom in odkrili mutacije pri 7 bolnikih (4%). Trije od teh so bili K601N, štirje pa V600E (najpogostejša mutacija BRAF pri melanomu 37 ). Naša ugotovitev pogostih mutacij BRAF pri večkratnem mielomu ima pomembne klinične posledice, saj lahko takšni bolniki koristijo zdravljenje z zaviralci BRAF, od katerih nekateri kažejo izrazito klinično aktivnost 38 . Naši rezultati podpirajo tudi opažanje, da imajo lahko inhibitorji, ki delujejo navzdol proti BRAF (na primer MEK) aktivnost pri multiplem mielomu 39 .

Mutacije genov: NF-κB pot

Drug pristop za prepoznavanje biološko pomembnih mutacij pri multiplih mielomih je, da ne gledamo na pogostost mutacij posameznih genov, temveč na množice genov.

Najprej smo razmislili o genskih setih, ki temeljijo na obstoječem vpogledu v biologijo multiplega mieloma. Na primer, aktivacija poti NF-κB je znana pri multiplih mielomih, osnova takšne aktivacije pa je le delno razumljena 2, 3 . Opazili smo 10 točkovne mutacije ( P = 0, 016) in 4 strukturne preureditve, ki vplivajo na 11 gena poti NF-κB (dodatna tabela 7): BTRC , CARD11 , CYLD , IKBIP , IKBKB , MAP3K1 , MAP3K14 , RIPK4 , TLR4 , TNFRSF1A in TRAF3 . Skupaj naše ugotovitve močno širijo mehanizme, s katerimi se lahko NF-κB aktivira pri multiplih mielomih.

Mutacije genov: encimi za spreminjanje histona

Nato smo iskali obogatitev v mutacijah v encimih, ki spreminjajo histon. Ta hipoteza je nastala zaradi našega opažanja, da je bil homeotični transkripcijski faktor HOXA9 močno izražen pri podskupini bolnikov z multiplim mielomom, zlasti tistih, ki jim ni znanih translokacij IgH (dopolnilna slika 4a). Ekspresijo HOXA9 uravnavajo predvsem histonske metiltransferaze (HMT), vključno s člani družine MLL. Občutljiva verižna reakcija polimeraze z reverzno transkripcijo (RT-PCR) analiza je pokazala, da je bil HOXA9 v resnici vseprisotno izražen v multiplih mielomih, pri čemer je večina primerov pokazala bialelično izražanje, ki je skladno z disregulacijo preko zgornjega dogodka HMT (dopolnilna slika 4b, c). V skladu s tem smo iskali mutacije v genih, za katere je znano, da neposredno uravnavajo HOXA9 . Ugotovili smo znatno obogatitev ( P = 0, 0024) z mutacijami v MLL , MLL2 , MLL3 , UTX , WHSC1 in WHSC1L1 .

HOXA9 se običajno utiša s kromatinskimi znamkami histona 3 lizina 27 (H3K27me3), kadar se celice ločijo od stopnje 40, 41 hematopoetskih matičnih celic. Ta represivna znamka je bila v lokusu HOXA9 v večini multiplih celičnih linij mieloma šibka ali odsotna (slika 3a). Poleg tega je obstajala obratna korelacija med ravnmi H3K27me3 in izražanjem HOXA9 (slika 3b), kar je skladno z disfunkcijo HMT, ki je prispevala k aberantni ekspresiji HOXA9 .

Image

a, obogatitev H3K27me3 na promotorju HOXA9 v celicah CD34, celicah CD19 in številnih celičnih mielomih glede na metilacijo H3K27me3 na mestu BC, za katero je znano, da se hipometilira v vseh celicah. b, Relativno izražanje HOXA9 proti obogatitvi s H3K27me3 na lokusu HOXA9 . c, konkurenčni test GFP v več celičnih linijah mieloma. Po lentivirusni okužbi s sedmimi HOXA9 shRNA ali kontrolno shRNA, ki cilja na luciferazo, smo GFP-pozitivne celice spremljali s protočno citometrijo in primerjali z deležem GFP-pozitivnih celic, prisotnih v populaciji 3 dni po okužbi (določen dan 0). Vrstice napak označujejo standardno napako srednje vrednosti in predstavljajo najmanj tri neodvisne poskuse.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Da bi ugotovili funkcionalni pomen izražanja HOXA9 v celicah z multiplim mielomom, smo njegovo ekspresijo podrli s sedmimi shRNA (dopolnilna slika 5). V 11 od 12 multiplih celičnih linij mieloma so bile izčrpane HOXA9 celice konkurenčne (slika 3c in dodatna slika 6).

Ti poskusi kažejo, da ima aberantna ekspresija HOXA9 , ki jo deloma povzročajo genomski dogodki, povezani s HMT, vlogo pri multiplem mielomu in lahko predstavlja novo terapevtsko tarčo. Nadaljnja podpora vlogi HOXA9 kot onkogena z multiplim mielomom je primerjalna genomska hibridizacija, ki temelji na matriki, prepoznala žariščne amplifikacije lokusa HOXA pri 5% bolnikov (dopolnilna slika 7).

Odkrivanje novih mutacij genskih skupin

Nato smo vprašali, ali je mogoče odkriti poti, obogatene za mutacije, če predhodnega znanja ni. V skladu s tem smo pregledali 616 naborov genov v bazi podatkov MSigDB Canonical Pathways. En vrhunski genski niz je bil zanimiv, ker se ni nanašal na gene, za katere je znano, da so pomembni pri multiplem mielomu. Ta genski niz kodira beljakovine, ki sodelujejo pri tvorbi fibrinskega strdka v kaskadi strjevanja krvi. Pri 5 od 38 bolnikov (16%, q = 0, 0054) je bilo 6 mutacij, ki kodirajo 5 beljakovin (dopolnilna tabela 8). RT-PCR analiza je potrdila izražanje 4 od 5 faktorjev koagulacije v celičnih linijah z mielomom (dopolnilna slika 8). Kaskada koagulacije vključuje številne zunajcelične proteaze ter njihove substrate in regulatorje, vendar o njihovi vlogi pri multiplih mielomih ni bilo sumljivo. Vendar pa se je pokazalo, da trombin in fibrin delujeta kot mitogena v drugih vrstah celic 42 in sta bila vpletena v metastaze 43 . Ta opažanja kažejo, da je treba mutacije koagulacijskega faktorja podrobneje raziskati pri ljudeh z rakom.

Mutacije v nekodiranih regijah

Analize nekodiranih delov genoma prej niso poročali. Osredotočili smo se na nekodirajoča področja z najvišjim regulativnim potencialom. Določili smo 2, 4 × 10 6 regulativnih potencialnih regij (dopolnilna slika 9), povprečno pa 280 baznih parov (bp). Nato smo te regije obravnavali, kot da so geni, ki kodirajo beljakovine, in jim podvrgli isto permutacijsko analizo, ki se uporablja za eksonične regije.

Identificirali smo več nekodirajočih regij z visokimi frekvencami mutacije, ki so spadale v dva razreda (tabela 2 in dodatna tabela 9). Prva ustreza regijam znane somatske hipermutacije. Te so za 1.000-krat višje od pričakovane mutacijske frekvence, kot je bilo pričakovati za celice B po zarodnih celicah (dodatna tabela 9). Ta območja vsebujejo imunoglobulinsko kodirajoče gene in 5 'UTR limfoidnega onkogena, BCL6 , kot so poročali 44 . Zanimivo je, da smo tudi pri petih bolnikih v intergeničnem območju, ki obdaja BCL6, ugotovili, da se somatska hipermutacija verjetno pojavi v regijah, ki presegajo 5 'UTR in prvi intron BCL6 (tabela 2). Ali takšne nekodirane mutacije BCL6 prispevajo k patogenezi multiplih mijelov, še ni ugotovljeno.

Tabela polne velikosti

Drugi razred je vseboval 18 nekodirajočih regij, katerih frekvenca mutacij presega pričakovano slučajno ( q <0, 25) (tabela 2 in dodatna tabela 10). Štiri od 18 regij so se spopadle z geni, ki so prav tako nosili kodiranje mutacij. Zanimivo je, da smo opazili 7 mutacij pri 5 od 23 bolnikov (22%) znotraj nekodiranih regij BCL7A , domnevnega tumorskega supresorskega gena, ki so ga odkrili v B-celičnem malignosti Burkitt limfoma 45 in ki je tudi izbrisan ali hipermetiliran v kožnem T- celični limfomi 46, 47 . Funkcija BCL7A ni znana, še vedno pa je treba ugotoviti učinek nekodirajočih mutacij v multiplih mielomih.

Naša predhodna analiza nekodiranih mutacij kaže, da lahko neeksonični deli genoma predstavljajo prej neizkoriščen vir vpogleda v patogenezo raka.

Diskusija

Analiza multiplih mielomskih genomov razkriva, da imajo mehanizmi, za katere se prej sumi, da igrajo vlogo v biologiji multiplaga mieloma (na primer aktiviranje NF-κB in disfunkcija HMT), zaradi mutacij v več članih teh poti široko vlogo. Poleg tega so predlagani potencialno novi mehanizmi transformacije, vključno z mutacijami v RNA eksonukleasti DIS3 in drugimi geni, ki sodelujejo pri prevajanju beljakovin in homeostazi. Ali bodo te mutacije značilne za multipli mielom ali so skupne drugim rakom, še ni določeno. Poleg tega so opazili pogoste mutacije v onkogeni kinazi BRAF - ugotovitev, ki ima takojšnje klinične translacijske posledice.

Pomembno je, da večine teh odkritij ni bilo mogoče opraviti s sekvenciranjem le enega samega genoma z multiplim mielomom - zapleteni vzorci disregulacije poti so zahtevali analizo več genomov. Celoeksomsko sekvenciranje je razkrilo veliko večino močno mutiranih genov. Vendar opažamo, da se je polovica mutacij, ki kodirajo beljakovine, zgodila s kromosomskimi aberacijami, kot so translokacije, od katerih večina ne bi bila odkrita s samo sekvenciranjem eksome. Podobno bi bile zamujene ponavljajoče se mutacije v nekodirajočih regijah z zaporedjem, usmerjenim samo na kodiranje eksonov.

Tu opisana analiza je predhodna. Za določitev dokončne genske pokrajine bolezni in določitev natančnih ocen pogostosti mutacije v bolezni bodo potrebni dodatni multipli mielomi. Podatki o zaporedju, opisani tukaj, bodo na voljo v skladišču dbGaP (//www.ncbi.nlm.nih.gov/gap) in ustvarili smo večkratni portal genomike mieloma (//www.broadinstitute.org/mmgp) za podporo podatkov analiza in vizualizacija.

Povzetek metod

Informirano soglasje več bolnikov z mielomom je bilo pridobljeno v skladu s Helsinško deklaracijo. DNK smo odvzeli iz aspirata iz kostnega mozga (tumor) in krvi (normalno). Knjižnice WGS (vstavki 370–410 bp) in knjižnice WES (vložki 200–350 bp) so bile konstruirane in sekvencirane na sekvenceru Illumina GA-II z uporabo branja s seznami s končnim odmikom 101 in 76 bp. Sekvenčni odčitki so bili obdelani s cevovodom Firehose, ki je identificiral somatske mutacije točk, indekse in druge strukturne kromosomske preureditve. Strukturne preureditve, ki vplivajo na območja, ki kodirajo beljakovine, so bile nato podvržene ročnemu pregledu, da se izključijo artefakti poravnave. Resnične pozitivne stopnje mutacije so bile ocenjene z genotipizacijo sekvenčne masne spektrometrije naključno izbranih mutacij. HOXA9 kratke lasnice (sh) RNA so bile vnesene v več celičnih linij mieloma z uporabo lentivirusne okužbe s standardnimi metodami.

Celoten opis materialov in metod je na voljo v dodatnih informacijah.

Pridružitve

Primarni pristopi

Omnibus genetske ekspresije

  • GSE26760
  • GSE26849
  • GSE26863

Vloge podatkov

Podatki o zaporedju so bili shranjeni v skladišču dbGaP (//www.ncbi.nlm.nih.gov/gap) pod pristopno številko phs000348.v1.p1. Dodatni podatki so bili poslani v Omnibus genetske ekspresije (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) pod pristopnima številkama GSE26760 (podatki GEP) in GSE26849 (podatki aCGH); oba nabora podatkov sta tudi združena pod pristopno kodo GSE26863. Ustvarili smo tudi portal za genomiko z multiplim mielomom (//www.broadinstitute.org/mmgp) za podporo analiziranju in vizualizaciji podatkov.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Datoteka vsebuje dodatne slike 1-14 z legendami, dopolnilnimi metodami in dopolnilnimi tabelami 1-16.

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.