Identifikacija alternativno zapletenih grim-19 mrna v tkivih raka ledvic | časopis za človeško genetiko

Identifikacija alternativno zapletenih grim-19 mrna v tkivih raka ledvic | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Nadomestno spajanje
  • Mutacija
  • Rak ledvic

Izvleček

Gen, povezan z umrljivostjo, ki jo povzroča retinoid-interferon ( GRIM ) -19, je bil prvotno opredeljen kot regulativni gen, potreben za smrt celične smrti, ki jo povzroča interferon-β in retinojska kislina. Nadaljnje študije so pokazale, da je GRIM-19 podenota kompleksa mitohondrijske dihalne verige I. Prejšnje študije kažejo, da se pri številnih karcinomih ledvičnih celic (RCC) in pri nekaterih urinogenitalnih tumorjih izražanje GRIM-19 izgubi ali močno pritisne. V genu GRIM-19 so ugotovili štiri točkovne mutacije pri tumorjih, bogatih z mitohondrijami (Hürthle), o enotočkovnih mutacijah pa so poročali v RCC. V tej študiji poročamo o alternativno spajkalni obliki GRIM-19 mRNA z intronom 3 z PCR z reverzno transkriptazo. To varianto spajanja najdemo v tkivih ledvičnih tumorjev, ne pa v normalnih tkivih. Poleg tega smo ugotovili, da se je poleg GRIM-19 raven beljakovin NDUFS3, ki je še ena podenota mitohondrijskega kompleksa I, zmanjšal tudi v tkivih ledvičnih tumorjev v primerjavi s seznanjenimi normalnimi tkivi. Naše ugotovitve kažejo, da je alternativna zmesna oblika GRIM-19 specifična za tumorsko tkivo.

Uvod

Rak ledvic predstavlja tretji vodilni vzrok smrti med genitourinarnimi malignomi in 12. vodilni vzrok smrti zaradi raka na splošno v ZDA. 1 Ocenjeno je bilo, da bodo v ZDA v letu 2007 zboleli 51 190 ljudi in 12 890 smrti pripisali raku ledvične in ledvične medenice. 2

3 genetski dejavniki imajo poleg kajenja cigaret, debelosti, hipertenzije in nekaterih poklicnih dejavnikov pomembno vlogo v etiologiji raka ledvic. Na primer, mutacije v genu von Hippel-Lindau ( VHL ), katerih izdelek deluje kot zaviralec tumorja z zaviranjem hipoksije, inducibilnih genov, vključenih v angiogenezo, rast celic in privzem glukoze, so povezane z karcinomom ledvičnih celic (RCC); 4, 5 mutacij v proto-onkogenu MET povzroči dedno papilarno RCC tipa 1. 6 Te redke genetske variante pojasnjujejo le majhen odstotek RCC, večino raka ledvic pa prispevajo genetske različice z nizkim ali zmernim tveganjem.

Ledvica je organ, bogat z mitohondriji. Znano je, da imajo rakave celice veliko nenormalnosti v svojih mitohondrijih, mutacije v mitohondrijski DNK in mitohondrijski geni, ki so kodirani, pa so povezane z raki. C je povezan z dovzetnostjo za rak endometrija. Hum. Mutat. 22, 173–174 (2003). "Href =" / Članki / jhg201057 # ref7 "aria-label =" Referenca 7 "> 7, 8, 9, 10, 11 Kot primer sta maternični leiomiomi in RCC povezani z mutacije v fumarat hidratazi

Gen, povezan z retinoidno-interferonsko povzročeno smrtnostjo ( GRIM ) - 19, je bil prvotno opredeljen kot regulacijski gen za celično smrt, saj je nujen za smrt tumorskih celic, ki jo povzročata interferon-β in retinojska kislina. 13 Pozneje je bilo dokazano, da je GRIM-19 nova podenota mitohondrijske NAPDH: ubikinon oksidoredutaza (kompleks I dihalne verige) in je ključnega pomena za kompleksno I sestavljanje, aktivnost in vzdrževanje potenciala mitohondrijske membrane. 14, 15, 16, 17 Motnja mitohondrijskega transmembranskega potenciala s pomočjo mutantov GRIM-19 povečuje občutljivost celic na apoptotične dražljaje. 17 Poleg tega se je pokazalo, da GRIM-19 zavira aktivnost pretvornika signala in aktivatorja transkripcije 3 (Stat3) in zavira v-Src onkogeno transformacijo in metastatsko vedenje celic. 18, 19 Tako je GRIM-19 dober kandidatni gen za preučevanje etiopatogeneze tumorjev, bogatih z mitohondriji.

Nedavno so poročali, da so somatske in zarodne mutacije (A26V, K88N, S83G in R198P) v GRIM-19 povezane s ščitničnimi tumorji, bogatimi z mitohondrijami, in izraz ICAM1 , nizvodni gen Stat3, je bil bistveno večji pri tumorjih z mutacije proti normalnim tkivom. Poleg tega je dokazano, da s tumorjem povezane mutacije GRIM-19 (K5N in R115P) poslabšajo anti-v-Src učinek GRIM-19 in znatno zmanjšajo njegovo sposobnost zatiranja v-Src-induciranih metastaz in vivo . 21 Glede raka ledvic je proteomska analiza pokazala, da je pri tem raku izguba izražanja GRIM-19. 22 Glede na vidno vlogo GRIM-19 pri raku smo sprožili raziskavo, da bi preučili, ali so v njem genske mutacije v tkivih ledvičnih tumorjev in v parnih normalnih tkivih.

Rezultati

Nov prepis GRIM-19, ustvarjen z alternativnim spajanjem

Genom GRIM-19 obsega pet eksonov, ki obsegajo in kodirajo protein s 144 aminokislinami. Po amplifikaciji celotnega transkripta GRIM-19 s primerji, specifičnimi za cIMNA GRIM-19 z uporabo cDNA iz ledvičnih tkiv kot predloge, smo v vseh normalnih tkivih našli le en PCR izdelek s 746 bp. Nasprotno pa smo v več kot 1/3 tumorskih tkiv opazili daljši izdelek z 1094 bp (slika 1). Po sekvenciranju teh dveh PCR izdelkov in primerjavi njunih zaporedij z javnim človeškim genomskim zaporedjem GRIM-19 (pristopna številka GenBank NC_000019) in z zaporedjem cDNA GRIM-19 (pristopna številka GenBank NM_015965) je bilo ugotovljeno, da je kratek fragment normalen prepis, ker dolg fragment vsebuje zaporedje, pridobljeno iz introna 3, verjetno z alternativnim spajanjem (slika 2). Vendar v vseh vzorcih niso zaznali točkovne mutacije. Med 37 vzorci RNA iz tumorskih ledvičnih tkiv ima 23 vzorcev samo normalen prepis, za 14 vzorcev (38%) pa je bilo ugotovljeno, da imajo dodatni mutantni prepis. Med 14 vzorci je 10 ledvično jasno celičnih karcinomov, ostali štirje vzorci pa iz tranzicijskega celičnega karcinoma, nefroblastoma, angiomiolipoma in mullerijskega adenosarkoma (tabela 1). V nasprotju s tem je bil mutantni prepis odsoten v njihovih enakih normalnih vzorcih. Tako je nenormalna oblika spajanja specifična za tumor ledvic.

Image

Slika gela agaroze normalnih in odklonskih prepisov. Normalni (746 bp) in daljši (1094 bp) prepisi smo razrešili na 1% agaroznem gelu in vizualizirali z barvanjem z etidijevim bromidom.

Slika v polni velikosti

Image

Zaporedje normalnega in odklonskega prepisa. ( a ) Delno zaporedje običajnega prepisa in prilagajalno mesto eksonov 3 in 4 je označeno s puščico. ( b ) nadomestna oblika spajanja. Priključitev eksona in introna 3 je označena s puščico. Zaporedje v rdečem okvirju je vneseni predčasni zaustavni kodon (TAG). ( c ) Shematski prikaz normalnih in mutantnih spojnih oblik in ustreznih PCR produktov gena GRIM-19 . Celotna barvna različica te številke je na voljo v spletni reviji Journal of Human Genetics .

Slika v polni velikosti

Tabela polne velikosti

V tumorskih tkivih je bila potisnjena ekspresija proteinov GRIM-19 in NDUFS3

Alternativno prepisana mRNA z intronom 3 uvaja TAG zaustavni kodon, kar vodi do prezgodnje mRNA, ki naj bi kodirala okrnjen protein GRIM-19. Za odkrivanje prisotnosti takšnih beljakovin smo normalna in seznanjena tumorska tkiva opravili z Western blot analizo. Vendar nismo mogli zaznati pričakovanega okrnjenega proteina GRIM-19 (slika 3). Iz testa Western blot smo opazili, da se je raven beljakovin GRIM-19 v tumorjih zmanjšala v primerjavi s seznanjenimi normalnimi tkivi, kar je skladno s prejšnjim poročilom. 22 Tako je GRIM-19 podenota kompleksa I mitohondrijev, ali je zmanjšano izražanje proteinov specifično za GRIM-19 ali se pojavlja v drugih podenotah kompleksa, vredno preveriti. S preučitvijo proteinske ekspresije druge podenote kompleksa I, NUDFS3, smo ugotovili, da se tudi v istem trendu zmanjša ekspresija NUDFS3, čeprav v nekaterih vzorcih zmanjšanje ni bilo tako očitno kot GRIM-19 (slika 3).

Image

Proteinske ekspresije GRIM-19 in NDUFS3 v normalnih in tumorskih tkivih. Enakomerno količino beljakovin smo naložili v 12% poliakrilamidni gel za Western blot test z aktinom kot nadzorom obremenitve. (Zgornje) Razen dveh podčrtanih vzorcev se je ekspresija proteinov G19 zmanjšala ali izgubila v tkivih tumorjev v primerjavi z ujemajočimi se normalnimi tkivi. (Spodaj) Pri teh vzorcih, katerih raven beljakovin G19 je bila v tkivih tumorjev znižana ali izgubljena, je bila tudi ekspresija proteina NDUFS3 zaznana z uporabo protitelesa NDUFS3 na isti blot kot G19. N, normalno; T, tumor.

Slika v polni velikosti

Alternativni transkript GRIM-19 je ustvaril okrnjen protein v celicah sesalcev

Ker nismo zaznali pričakovanega okrnjenega proteina GRIM-19, smo želeli vedeti, ali lahko alternativni transkript prevedemo v krajši protein kot domači GRIM-19 v celicah. Tako smo konstruirali plazmid, ki eksprimira normalno ali mutirano GRIM-19 cDNA z intronom 3 in jih izrazimo v HeLa celicah. Po transfekciji so odkrili pričakovani okrnjeni protein (slika 4). To je nakazovalo, da se lahko alternativni transkript, ki kodira mutantni protein GRIM-19, izrazi v celicah. Ker iz kliničnih vzorcev nismo opazili okrnjenega proteina GRIM-19, ni jasno, ali je to posledica nestabilnosti okrnjenega proteina alternativnega prepisa v tumorskih tkivih. Prav tako je izvedljivo, da se protein, kodiran z mutantnim GRIM-19, spremeni po sintezi in nima kritičnega epitopa, ki ga prepozna anti-GRIM-19.

Image

Prekomerna ekspresija normalnega in alternativnega transkripta ter praznega vektorja v celicah HeLa. Pričakovani okrnjeni protein je bil odkrit po prehodni transfekciji. V: prazen vektor; 164: plazmid, ki izraža nativni GRIM-19; 164intron3: alternativni transkript plazmida, ki izraža intron 3.

Slika v polni velikosti

Diskusija

V tej študiji smo s presejanjem mutacije GRIM-19 z uporabo kliničnih vzorcev ugotovili, da je 14 -krat od 37 bolnikov poleg običajnega prepisa GRIM-19 v tumorskih tkivih vnesel še dodaten prepis z intronom 3, ne pa v seznanjenih normalnih tkivih . Med temi vzorci tumorjev ni bilo ugotovljenih točkovnih mutacij. Vendar je bila raven beljakovin GRIM-19 pri večini bolnikov znižana in celo izgubljena (97%). To je v skladu s prejšnjim poročilom. 22 Nadalje smo pokazali, da upadanje pri izražanju beljakovin ne obstaja samo v GRIM-19, ampak tudi v NUDFS3, drugi podenoti kompleksa I. Čeprav beljakovine s pričakovano manjšo velikostjo, ki jo je verjetno kodiral mutantni spojnik, v teh ni bilo mogoče zaznati V vzorcih tkiv lahko ta prepis variante prevedemo v protein s pričakovano manjšo molekulsko maso, ko ga transficiramo v celice HeLa.

Zanimivo je, da je bilo odkritih 10 od 14 vzorcev RCC (∼ 71%), ki izražajo varianto spajanja, kar kaže na možno povezavo med izražanjem spojnega mutanta in določenim histotipom ledvičnega tumorja. Vendar so odkrili mutantni transkript odkrili tudi pri drugih štirih vzorcih iz prehodnih celičnih karcinomov, nefroblastoma, angiomiolipoma in mullerijskega adenosarkoma. Povezava s temi vrstami tumorjev ni jasna zaradi majhnega števila vzorcev. V celoti je oblika mutantnega prepisa specifična za ledvične tumorje, vendar je potreben nadaljnji preskus več vzorcev, da se ugotovi njegova povezanost z različnimi tumorskimi histotipi.

Post-transkripcijski predpisi, kot so spajanje nezrele messenger RNA (pre-mRNA), so temeljni za ustvarjanje zrele mRNA, pripravljene za prevajanje v beljakovine. 23 Aberantno spajanje je povezano z aktiviranjem onkogenov in inhibicijo genov, ki zavirajo tumorje, pri različnih človeških rakih. 24 Kopičenje dokazov kaže na to, da se med onkogeno transformacijo celic spreminjajo mehanizmi za celično cepljenje, čeprav je treba razjasniti mehanizem za te spremembe. 23, 25 Ker je vzrok za nastanek raka, je treba alternativno variko, ki je verjetno, izraziti na visoki ravni v primerjavi s pravilno zlepljenimi izdelki. 24 Večina aberantnih mRNK pa se razgradi z neumno posredovano potjo propadanja mRNA; 26 nekatere nove vrste mRNA lahko prinesejo znižanje normalne ravni beljakovin ali ustvarijo različne izoformne beljakovine s potencialno tumorskimi lastnostmi. V našem primeru niso odkrili aberantnih beljakovin, čeprav smo našli alternativno obliko mRNA za spajanje. Ena od možnosti je, da alternativna spojena mRNA razpade, preden jo prevedemo. Različico transkripta lahko prevedemo na nenormalne beljakovine, ki jih proteinaza hitro uniči in razgradi. Trenutno nam ni jasno, ali lahko alternativna oblika zmesi pomembno prispeva k razvoju raka ledvic ali pa nastane med razvojem raka ledvic. Ta vprašanja je treba še preučiti.

Poročeno je, da se pri številnih primarnih RCC in pri nekaterih urinogenitalnih tumorjih ekspresija proteina GRIM-19 izgubi ali močno pritisne. 22 Naši rezultati so nadalje potrdili izgubo ali zmanjšano izražanje GRIM-19 v RCC, pa tudi pri drugih tumorjih ledvic, kot so nefroblastom, mullerični adenosarkom, tranzicijski celični karcinom in angiomiolipom. Poleg tega sprememba ni značilna samo za GRIM-19, ampak se je zgodila tudi z NDUFS3, drugo podenoto kompleksa I. Mehanizem za znižanje ravni GRIM-19 in NDUFS3 v RCC in drugih tumorjih ledvic je treba še razjasniti. Obstaja nekaj možnosti. Prvič, genetska sprememba lahko temelji na zatiranju proteina GRIM-19. Glede na dejstvo, da v kodirnem območju tega gena niso bile odkrite mutacije, ali obstajajo nekatere funkcionalne genske spremembe v regulativnih regijah, kot so promotor, 5 'in 3' nekodirajoče območje, pa tudi drugi geni, ki nadzorujejo izražanje GRIM-19 in NDUFS3 sta vredna nadaljnje preiskave. Druga možna razlaga je, da se hitro razgradi protein GRIM-19, ki ga lahko posredujejo nekatere proteinaze, ki so prekomerno aktivne pri ledvičnih tumorjih. Tudi druge možnosti, kot je na primer avtofagija, razkroj mitohondrij, ni mogoče izključiti.

Pogosta izguba ali zaviranje izražanja proteinov GRIM-19 pri ledvičnih rakih kaže na vlogo GRIM-19 pri tumorigenezi ledvic. Kako natančno je GRIM-19 vključen v ta postopek, večinoma ni znano. Primarna funkcija GRIM-19 je podenota mitohondrijskega kompleksa I. Ker je GRIM-19 bistvenega pomena za sestavo kompleksnega dela in aktivnost prenosa elektronov, je izguba njegove ekspresije v RCC in drugih rakih ledvic lahko povezana z oslabljeno funkcijo sistem proizvodnje mitohondrijske energije. Podobno zmanjšano izražanje NDUFS3 podpira hipotezo. Poleg tega smo pokazali, da knockdown GRIM-19 ali NDUFS3 preprečuje apoptozo, ki jo povzročata interferon-β in retinojska kislina. 16 Možno je tudi, da znižanje vrednosti GRIM-19 in NUDFS3 ne samo moti sklop kompleksnega I in zmanjša aktivnost dihalnih verig mitohondrijev, ampak tudi zmanjša apoptotično sposobnost, kar lahko koristi rasti rakavih celic. Ker je GRIM-19 tudi zaviralec Stat3, ki je onkogen, lahko izguba GRIM-19 pri raku ledvic aktivira Stat3 in privede do razvoja ledvičnega raka.

Če povzamemo, so pri rakih ledvic ugotovili alternativno spajkalno obliko GRIM-19, ta aberantna zmes je specifična za tumor ledvic. Posebna vloga GRIM-19, vključno z njegovo različico spajanja, pri raku ledvic in vključeni mehanizem sta pomembni vprašanji za prihodnje preiskave.

Pridružitve

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NC_000019
  • NM_015965