Hipotalamični nevroni v obliki hipotalamičnih snovi simulirajo kompleksno vedenje po stresu | narave komunikacije

Hipotalamični nevroni v obliki hipotalamičnih snovi simulirajo kompleksno vedenje po stresu | narave komunikacije

Anonim

Predmeti

  • Nevronska fiziologija
  • Družbeno vedenje
  • Stres in odpornost

Izvleček

Vsi organizmi imajo prirojene vedenjske in fiziološke programe, ki zagotavljajo preživetje. Da bi imeli kar največjo prilagodljivo korist, morajo biti ti programi dovolj prilagodljivi, da lahko upoštevajo spremembe v okolju. Tukaj prikazujemo, da hipotalamični CRH nevroni orkestrirajo okolju prilagodljiv repertoar vedenj, ki se pojavijo po akutnem stresu pri miših. Optično utišanje nevronov CRH moti organizacijo posameznega vedenja po akutnem stresu. Ti vedenjski vzorci se po stresu spreminjajo glede na okolje, vendar se ta občutljivost okolja izniči z aktiviranjem PVN CRH nevronov. Te ugotovitve dokazujejo, da so celice PVN CRH del prej neraziskanega vezja, ki po stresu ustreza natančnim vedenjskim vzorcem in okoljskim okoliščinam. Prekomerna aktivnost v tej mreži, če ni stresa, lahko prispeva k okoljski ambivalenci, kar ima za posledico neprimerne vedenjske strategije.

Uvod

V vseh organizmih zaznana grožnja sproži specifične vedenjske spremembe in spremljajoče fiziološke odzive, da se zagotovi preživetje 1, 2 . Temeljno vezje, ki je odgovorno za to hitro obrambno vedenje ob pojavu stresa, je bilo obsežno preučeno 3, 4 . Manj je znanega o vedenjih, ki sledijo takoj po stresnem dogodku. Trenutni opisi teh vedenj kažejo, da so zapletena in različna; vključujejo vedenja, povezana z okoljsko presojo, budnostjo in izogibanjem tveganjem (to je lokomotiranje, raziskovanje, neofobija) 5, pa tudi vedenja, ki so samosvoja in na videz dvosmerna do zunanjih znakov (to je samooskrba) 6, 7, 8, 9 . Glede na vedenjske patologije, ki se lahko razvijejo po izpostavljenosti stresnim situacijam 10, bo jasnejše razumevanje osnovnega nevronskega vezja, ki nadzira vedenje po akutnem stresu, nov okvir za preučevanje kalitve stresnih motenj.

Tu smo uporabili akutni eksperimentalni stres (stopalo) za sprožitev stresnega odziva in nato preučili celoten vedenjski repertoar v različnih okoljskih okoliščinah po prenehanju stresa. Hipotetizirali smo, da je posamezno vedenje po stresu del širšega vedenjskega vzorca, sestavljenega iz več vedenjskih vzorcev 11, ki omogoča, da se živali vrnejo k spontanemu vedenju. Posebej smo se osredotočili na celice hormona, ki sprošča kortikotropin (CRH), paraventrikularnega jedra (PVN) hipotalamusa. Te celice so odgovorne za sprožitev endokrine komponente odziva na stres pri sesalcih 12, vendar obstajajo znaki, da lahko uravnavajo tudi kompleksno vedenje po stresu. To idejo podpirajo poročila, da električna aktivacija PVN in okoliških regij sproži samooskrbo 7, 8, vedenje, opaženo po stresu pri mnogih vrstah, tako v poskusnih kot naravnih razmerah 8, 9, 13 . Kanonični prikaz PVN CRH nevronov kot endokrinih celic, ki sprožijo hormonsko kaskado, ki lahko zahtevajo več deset minut, da vplivajo na možganska vezja 14, je v nasprotju s temi celicami pri hitrem vedenju po stresu. Bolj verjeten scenarij je, da poleg pošiljanja terminalnih aksonov na krvne žile v mediani eminence nevroni PVN CRH pošiljajo tudi stranske projekcije v sosednje hipotalamične regije 15 . Ta poročila ponujajo verodostojno alternativo, s pomočjo katere lahko nevroni PVN CRH nadzirajo hitro vedenje po stresu 16 .

Tu smo uporabili celično specifična orodja, s katerimi smo neposredno ciljali na PVN CRH nevrone 17 in preizkusili hipotezo, da imajo ti nevroni ključno vlogo pri orkestriranju zapletenih vedenj po stresu. Naše ugotovitve kažejo, da: (i) vedenja po stresu kažejo organizirano strukturo; (ii) ima ta organizacija izrazite, a prožne časovne značilnosti, ki so občutljive na nevronsko aktivnost PVN CRH in okolje; (iii) Obstaja vzajemno razmerje med okoljskimi rešitvami in nevronsko dejavnostjo PVN CRH pri nadzoru specifičnega vedenja. Razumevanje specifičnih vozlišč, ki nadzirajo vedenjsko zaporedje po stresu, lahko ponudi edinstvene vpoglede, ki nam olajšajo razumevanje, kako možgani pomagajo, da se po stresu ponovno postavijo.

Rezultati

Količinsko določanje več vedenj po stresu

Da bi preučili učinke posamezne epizode stresa (stopničk) na vedenje miške, smo najprej količinsko opredelili vsa vedenja v 15-minutnem obdobju opazovanja v domači kletki (HC). Zaznali smo lahko osem različnih vedenj: raziskovanje, negovanje, kopanje, hoja, žvečenje, vzreja, zamrzovanje in spanje (sl. 1a). To vedenje se je v obdobju opazovanja pokazalo naključno, brez očitnih vzorcev ali pristranskosti (slika 1a-g). Drugo skupino miši smo premestili v nožno komoro, podvrgli vrsti stopničk in nato vrnili v HC na opazovanje. Čeprav so opazili enaka osem vedenja, je prišlo do več razlik: Konkretno je prišlo do večjega števila nošenj (slika 1b – d, dopolnilna slika 1a, b in dodatni film 1), vzreje (slika 1b, e, f) in hoja (slika 1b, g, h). Pri kopanju in žvečenju je prišlo do občutnega zmanjšanja. Raziskovanje, spanje in zamrzovanje niso vplivali. Naslednjič smo se osredotočili na časovno organizacijo, posebej na vedenja, ki so se po stresu povečala. Pred stresom ta vedenja niso pokazala opazne časovne pristranskosti ali organizacije (slika 1c – h); srednji čas za katero koli vedenje se ni bistveno razlikoval od polčasa (HT) obdobja opazovanja (HT = 450 s; dopolnilna slika 1c-e). Poleg tega so med negovanjem, vzrejo in hojo pokazali linearno kumulativno povečanje v obdobju opazovanja. Po stresu se srednji čas za nego ne premakne s HT (dopolnilna slika 1c). Vendar je prišlo do pomembnega premika v srednjih časih za rejo (dodatna slika 1d) in hojo (dodatna slika 1e) proti začetku opazovalnega obdobja. Ta opažanja kažejo, da miši uporabljajo isto vedenjsko paleto posameznih vedenj pred stresom in po njem, vendar je organizacija teh vedenj in čas, ki je dodeljen vsakemu vedenju, različen. Konkretno takoj po stresu obstaja nagnjenost k raziskovalnemu vedenju, ki se med opazovalnim obdobjem zmanjšuje, in zanesljivo povečanje obnašanja. Ta analiza ponuja predlogo za vedenjski vzorec takoj po akutnem stresu, ki ga je zdaj mogoče uporabiti za raziskovanje nevronskih vezij.

Image

( a ) Kvantifikacija vedenjske aktivnosti v 15-minutnih epohah v domači kletki (HC) naivnih miši in miši takoj po stopanju stopala. Pri naivnih (N, levo) in pod stresom (S, desno) je mišljenih osem izrazitih vedenj. Vsaka vrstica predstavlja eno miško. ( b ) negovanje (naiv: 124, 8 ± 33, 2 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 294, 0 ± 33, 4 s, n = 9; P = 0, 0024; t- test), reja (naivno: 19, 7 ± 4, 8 s, n = 9 v primerjavi s stresom : 64, 7 ± 10, 0 s, n = 9; P = 0, 0012; t- test) in hoja (naivno: 76, 4 ± 14, 2 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 171, 4 ± 27, 0 s, n = 9; P = 0, 0067; t- test ) se po stresu povečajo. Čas kopanja (naiv: 122, 5 ± 28, 9 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 7, 5 ± 5, 0 s, n = 9; P = 0, 0012; t- test) in žvečenje (naivno: 61, 5 ± 21, 1 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 14, 0 ± 7, 4 s, n = 9; P = 0, 0492; t- test) se zmanjšajo. Anketiranje (naivno: 369, 9 ± 65, 1 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 282, 8 ± 31, 6 s, n = 9; P = 0, 2463; t- test), spanje (naivno: 124, 3 ± 85, 3 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 59, 5 ± 44, 4 s, n = 9; P = 0, 55096; t- test) in zamrzovanje (naivno: 0, 6 ± 0, 6 s, n = 9 v primerjavi s stresom: 2, 6 ± 1, 6 s, n = 9; P = 0, 2541; t- test) ne vplivajo . ( c - h ) Odstotek živali, ki v vsaki časovni točki kažejo navedeno vedenje, in kumulativni grafi, ki prikazujejo relativni obseg negovanja ( c, d ), vzreje ( e, f ) in hoje ( g, h ). Lestvice: c - h, 20%; NS, ni pomembno; * P <0, 05; ** P <0, 01; Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

Fotoinhibicija nevronov PVN CRH po stresu

Že prej so poročali o močnem povečanju nege po stresu 7, 18 in domneva se, da lahko PVN nevroni nadzirajo natančno določanje časa nege glede na druga vedenja 19 . Druge študije pa poročajo, da PVN lezije ne vplivajo na negovanje po stresu 20 . Za neposredno oceno prispevka PVN CRH nevronov v negovanju in s tem povezano vedenje po stresu smo uporabili miši, ki izražajo Archaerhodopsin 3.0 v CRH nevronih (CRH Arch3.0 ) 21, da bi zmanjšali streljanje posebej v PVN CRH nevronih (slika 2a-d). Učinke svetlobe na vedenje so vedno primerjali s kontrolnimi CRH eYFP mišami 22, 23 (Dopolnilni film 1). Najprej smo z uporabo možganskih rezin potrdili, da oddajanje rumene svetlobe zanesljivo zavira streljanje v CRH nevrone iz miših CRH Arch3.0 (pogostost akcijskih potencialov: 7, 7 ± 6, 7% izhodiščne vrednosti P = 0, 0168, n = 5, ponovljeno ukrepanje enosmerno analiza variance (ANOVA)). Poleg tega nismo opazili nobenega ponovnega povečanja aktivnosti CRH nevronov po prenehanju optične inhibicije (pogostost akcijskih potencialov: 62, 5 ± 51, 0% izhodiščne vrednosti, P > 0, 9999, n = 5, ponovljeni ukrepi enosmerni ANOVA). Nato so bile miši izpostavljene stopanju stopala in neprekinjena rumena svetloba je bila 15 minut oddana v PVN med opazovanjem HC (slika 2e, dopolnilna slika 2a, b in dodatni film 2). To je zmanjšalo čas, porabljen za nego (sl. 2f – h in dopolnilno sliko 2c, d), povečal čas porabe za rejo (slika 2i – k in dodatna slika 2e) in hojo (slika 2l – n in dodatna slika 2f ). Vendar je časovna organizacija teh vedenj ostala nespremenjena (dopolnilna slika 3l – n). Na drugo vedenje ni vplivala fotoinhibicija CRH nevronov (dodatna slika 2g – k). Da bi ugotovili, ali relativne spremembe skupnega časa, porabljenega za dano vedenje, odražajo preprosto prerazporeditev časa ali so bila posebna vedenja naklonjena po utišanju nevronov CRH, smo preučili relativni čas, porabljen za vzrejo ali hojo, potem ko smo odstranili čas, dodeljen negi. Prišlo je do znatnega povečanja frakcijske časovne reje (slika 2k) in hoje (slika 2n), kar kaže, da se je to vedenje prednostno povečalo po utišanju nevronov PVN CRH. Ker stres povečuje kroženje glukokortikoidov (CORT) 12, smo preizkusili potencialno povezavo med CORT-om in negovanjem. Blokiranje sinteze CORT 1 h, preden se je stopalica izmuznila, se poveča odzivnost CORT-a (dodatna slika 3a, b), vendar ni vplivala na negovanje (dodatna slika 3c) ali vzrejo (dodatna slika 3d). Za oceno vloge PVN CRH nevronov pri uravnavanju vedenja v odsotnosti stresa smo utišali CRH nevrone naivnih miši. Nismo opazili nobene razlike v vedenjskem vzorcu miši kot odziv na optično inhibicijo v naivnem stanju (dopolnilna slika 4a-d). Skupaj ta opažanja kažejo, da je vztrajna aktivnost PVN CRH nevronov, ki sledijo stopalu, potrebna za uravnavanje specifičnega vedenja, vendar se to zgodi neodvisno od CORT-a.

Image

( a ) Virus AAV-DIO-Arch3.0-eYFP, ki je bil injiciran v PVN, od Cre- a . ( b ) Shematski zemljevidi prikazujejo mesto injiciranja (levo) in mesto implantacije svetlobnega vretena (desno). ( c ) Konfokalna slika prikazuje izražanje Arch3.0-eYFP (zelena) in tdTomato (rdeča) v PVN. ( d ) Dobava rumene svetlobe na rezino (označena z rumenim poljem) zmanjšuje streljanje PVN CRH nevronov v trenutni objemki. Spodnji, povzeti histogram spodaj od akcijskih potencialov tvori ponavljajoča preskušanja. ( e ) Podrobna analiza prikazuje vseh osem vedenj pri živalih CRH eYFP (levo) in CRH Arch3.0 (desno) v 15-minutni epohi takoj po stopalu. Vsaka vrstica predstavlja eno žival. ( f ) Histogrami prikazujejo odstotek živali, ki v 15-minutnem obdobju opazovanja negujejo živali v vsaki skupini. ( g ) Kumulativni graf ponazarja relativno negovanje v vsakem stanju. ( h ) Povzetek grafov, ki kažejo, da je med optično inhibicijo PVN CRH nevronov zavirano negovanje (CRH eYFP : 181, 4 ± 28, 7, n = 10 v primerjavi s CRH Arch3, 0 : 79, 0 ± 11, 2, n = 8; P = 0, 0080; t- test). ( i ) Histogrami prikazujejo odstotek rej živali v vsaki skupini v 15-minutnem obdobju opazovanja. ( j ) Kumulativni graf ponazarja relativno rejo. ( k ) V času fotoinhibicije se poveča čas vzgoje, kot del vsega nege vedenja (CRH eYFP : 4, 5 ± 0, 8%, n = 10 v primerjavi s CRH Arch3, 0 : 8, 6 ± 1, 5%, n = 8; P = 0, 0229 ; t- test). ( l ) Histogrami prikazujejo odstotek hoje v vsaki skupini v 15-minutnem obdobju opazovanja. ( m ) Kumulativni graf ponazarja relativno hojo. ( n ) Delni čas hoje se poveča tudi med fotoinhibicijo PVN CRH nevronov (CRH eYFP : 12, 2 ± 2, 0%, n = 10 v primerjavi s CRH Arch3, 0 : 22, 0 ± 2, 7%, n = 8; P = 0, 0084; t- test) . Lestvice: ( c ), 50 μm; ( d ), 2 Hz in 1 s; ( f, g, i, j, l, m ), 20%; NS, ni pomembno, * P <0, 05; ** P <0, 01; Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

Fotoaktivacija nevronov PVN CRH

Za preverjanje učinkov aktivacije nevronov CRH smo v odsotnosti zunanjega stresa Channelrhodopsin 2 (ChR2) enostransko izrazili v CRH nevronih (CRH ChR2 ) 21 (slika 3a-c). Na možganskih rezinah smo potrdili, da modra svetloba zanesljivo sproži navznoter tokove in trni v CRH ChR2 nevrone pri frekvencah do 20 Hz (slika 3d). Za nadziranje CRH aktivnosti in vivo smo na mesto injiciranja vsadili optično sondo ipsilateralno (dodatna slika 5a, b). Kot je bilo pričakovano, je fotostimulacija PVN pri miših CRH ChR2 povečala kroženje CORT (slika 3e) in povečala število c-Fos-pozitivnih celic v PVN (dopolnilna slika 5c-e). Nato smo v opazovalni komori, v katero so bile miši naseljene (HAB), fotostimulirali naivne ( nenapete) miši CRH ChR2 . To je sprožilo robustno negovanje (dodatna slika 6a in dodatni film 3) s hitrim začetkom. Ob prenehanju fotostimulacije je vedenje prenehalo takoj (dodatna slika 6a). Da bi preučili učinke aktivacije PVN CRH v okolju HAB in ocenili različna vedenja, smo izvedli dodatne poskuse, med katerimi smo oddajali modro svetlobo za 5 min (slika 3f). Fotostimulacija je v 5-minutnem obdobju opazovanja povečala negovanje (slika 3g – i). Prav tako je konstantno zmanjševal tako absolutno rejo (slika 3j – l in dopolnilno sliko 6b) kot tudi frakcijsko rejo (slika 3l). Fotostimulacije na hojo (slika 3m – o in dopolnilna slika 6c) ni bilo vpliva (dopolnilna slika 6d, e). Nato smo vprašali, ali so te spremembe v vedenju občutljive na spreminjanje frekvence fotostimulacije. Opazili smo linearno povečanje nege s povečevanjem frekvenc od 1 do 20 Hz. Spremljalo ga je postopno, od pogostosti odvisno zmanjšanje reje (dodatna slika 6f). Optična stimulacija nevronov PVN CRH ni vplivala na časovno organizacijo nege, vzgoje in hoje (dodatna slika 6g-i). Ta opažanja kažejo, da specifična aktivacija PVN CRH zadostuje za povečanje nege in zmanjšanje reje.

Image

( a ) Sestava virusa AAV-DIO-ChR2-eYFP, ki je odvisen od Cre. ( b ) Shematski zemljevidi prikazujejo vbrizganje virusa v PVN miši CRH-Cre / tdTomato (levo) in mesto implantacije lahkega ferrula (desno). ( c ) Konfokalna slika prikazuje izražanje ChR2-eYFP (zelena) in tdTomato (rdeča) v PVN. ( d ) Optična stimulacija v trenutni objemki (zgoraj) in napetostna spona (spodaj) prikazuje oddajanje modre svetlobe, ki zanesljivo nadzoruje PVN CRH nevrone. ( e ) Vzorci krvi, odvzeti pred in 15 min po začetku optične stimulacije, kažejo povečanje ravni CORT, zlasti pri miših CRH ChR2 (CRH eYFP : povečanje 0, 528 µg dl- 1, n = 6; v primerjavi s CRH ChR2 : 5, 327 µg dl −1 povečanje, n = 5; P = 0, 0316; t- test). ( f ) Podrobna analiza prikazuje vzorec osmih različnih vedenj, ki so jih opazili pri živalih CRH eYFP (levo) in CRH ChR2 (desno) med 5 min optične stimulacije v opazovalni komori, kjer so bile mišje prej naseljene brez stresa. Vsaka vrstica predstavlja eno žival. ( g ) Histogrami prikazujejo odstotek živali, ki se med optično stimulacijo negujejo v vsaki skupini. ( h ) Kumulativni graf ponazarja sorazmerno veliko dojenosti. ( i ) Optična stimulacija nevronov PVN CRH je podaljšala čas negovanja (CRH eYFP : 6, 8 ± 1, 9 s, n = 12; v primerjavi s CRH ChR2 : 112, 6 ± 13, 6 s, n = 11; P <0, 0001; t- test). ( j ) Histogrami prikazujejo odstotek živali, ki se med optično stimulacijo vzrejajo v vsaki skupini. ( k ) Kumulativni graf ponazarja relativno rejo. ( l ) Čas vzgoje kot del vedenj, ki ne dojijo, se zmanjša s fotostimulacijo nevronov CRH (CRH eYFP : 9, 9 ± 1, 5%, n = 12; v primerjavi s CRH ChR2 : 5, 4 ± 1, 4%, n = 11; P = 0, 0396; t- test). ( m ) Histogrami prikazujejo odstotek živali, ki hodijo med optično stimulacijo. ( n ) Kumulativni graf ponazarja relativno hojo. ( o ) Delni čas hoje ni spremenjen z optično stimulacijo (CRH eYFP : 28, 8 ± 3, 4%, n = 12; v primerjavi s CRH ChR2 : 28, 7 ± 3, 8%, n = 11; P = 0, 9784; t- test). Lestvice: c, 50 μm; d, zgoraj: 200 pA in 500 ms, spodaj: 20 mV in 200 ms; ( g, h, j, k, m, n ), 20%; NS, ni pomembno, * P <0, 05; **** P <0, 0001; Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

PVN CRH nevroni ciljajo na diskretno populacijo celic v LH

Axonovi kolaterali iz PVN CRH nevronov so opisani v lateralnem hipotalamusu (LH) 15 . Poleg tega PVN CRH nevroni izražajo tudi mRNA za vezikularni transporter 2 glutamata (VGluT2) 24, ki zagotavlja substrat za hiter sinaptični prenos. Za preiskavo domnevnega nevronskega vezja navzdol od CRH nevronov smo 5 minut oddali modro svetlobo in vivo (slika 4a), 2 uri kasneje pa ubili miši in predelali možgansko tkivo za c-Fos. V LH je prišlo do povečanja c-Fos-pozitivnih celic (slika 4b, c). Za neposredno preizkušanje prispevka štrleče k LH je bilo v LH enostransko nameščeno vlakno za stimulacijo aksonskih sponk (slika 4d in dodatna slika 7a, b). Fotostimulacija vlaken je povečala negovanje (slika 4d). V LH (slika 4e, f in dopolnilna slika 8a-c) je bilo razvidno, da je v omrežju LH (slika 4e, f in dodatna slika 8a-c) vidna mreža ojačanih belih fluorescentnih beljakovin (eYFP). V ekstrahipotalamičnih območjih ni bilo nobenih pozitivnih eYFP vlaken, za katere je bilo znano, da prejemajo vnos PVN 25, 26 ali so bili vpleteni v vedenje nege 27 (dopolnilna slika 8d-i). Če želite vprašati, ali se PVN CRH nevroni, ki projicirajo na LH, razlikujejo od PVN CRH nevronov, ki štrlijo v srednjo eminenco, smo izvedli dvojni retrogradni sledilni poskus. V repno veno smo vbrizgali fluorogold (dopolnilna slika 9a), da smo nevrone označili z aksonskimi štrlečicami, ki se končajo zunaj krvno-možganske pregrade (endokrino) in tudi vbrizgali fluorescenčne kroglice v perifornično območje LH (dopolnilna slika 9b), da se označimo celična telesa, ki imajo mesta sproščanja v LH. Fluorogold in retrobeads so bili lokalizirani v podskupini PVN CRH nevronov, skladnih s hipotezo, da posamezni nevroni hkrati štrlijo na srednjo eminenco in LH (dopolnilna slika 9c). Za neposredno karakterizacijo funkcionalnega sinaptičnega prenosa iz CRH aksonskih vlaken na LH nevrone smo dobili in vitro celocelične posnetke iz LH nevronov (slika 4f). Glede na hitro latenco, blokado s tetrodotoksinom in poznejšo delno okrevanje v prisotnosti 4-aminopiridina 28 sklepamo, da so te povezave monosinaptične. Farmakološki poskusi, ki prikazujejo popolno blokado z antagonistom AMPA / kainatnega receptorja, 6, 7-dinitrokinoksalin-2, 3-diona (DNQX), kažejo, da so sinapse glutamatergične (slika 4g-j). Poleg tega smo preizkusili učinke antagonista CRHR1 na evocirani prenos in nismo videli nobenega učinka na posamezne ekscitatorne postsinaptične tokove ali vlake vznemirljivih postsinaptičnih tokov (podatki niso prikazani). Zanimivo je, da se na fotostimulacijo niso odzvali vsi testirani nevroni LH. Na podlagi električnih prstnih odtisov smo opazili dva različna podtipa. Celice z izrazito zamudo do prvega konice kot odgovor na vbrizg depolarizirajočega toka in linearno tokovno-napetostno razmerje se niso odzvale na optično stimulacijo CRH vlaken (neodgovorniki, slika 4k). V nasprotju s tem so celice z večjo hitrostjo streljanja (slika 4l) in izrazitim "zgibanjem" v membranskem potencialu (slika 4k – n) vedno reagirale na fotostimulacijo (odzivniki). Ta opažanja kažejo, da nevroni PVN CRH pošiljajo ekscitacijske, glutamatergične projekcije na elektrofiziološko izrazito populacijo nevronov v LH.

Image

( a ) Shema eksperimentalne zasnove. ( b ) c-Fos-pozitivne celice v LH CRH eYFP in CRH ChR2 po fotostimulaciji v PVN. ( c ) Povzetek podatkov c-Fos v LH (CRH eYFP : 100, 5 ± 21, 1, n = 4 v primerjavi s CRH ChR2 : 318, 8 ± 60, 4, n = 5; P = 0, 0179; t- test). ( d ) Fotostimulacija in vivo v LH (20hz, 5 min) poveča čas negovanja (CRH eYFP : 5, 4 ± 3, 0 s, n = 3; v primerjavi s CRH ChR2 : 36, 9 ± 7, 3 s, n = 7; P = 0, 0264; t- test ). ( e ) Shematski zemljevid in eksperimentalna zasnova posnetkov celičnih celic in vitro iz LH nevronov. ( f ) Zabeleženi nevroni, napolnjeni z biocinom, v LH (rdeči), obdani z vlakni, ki izražajo ChR2-eYFP (zelena). ( g ) V napetostni objemki (HP = -80 mV) modra svetloba (2–5 ms) sproža hitre notranje vhodne tokove (latenca: 4, 7 ± 0, 3 ms), ki jih TTX odpravi (izhodiščna vrednost: 103, 1 ± 2, 0 pA v primerjavi s TTX: 4, 7 ± 0, 7 pA, n = 8; P <0, 0001; večkratno enosmerno ANOVA) in delno obnovljeno s povečanjem trajanja svetlobnega impulza (7, 5–10 ms) med uporabo 4-aminopiridina (4-AP) 28, 44 ( 40, 1 ± 9, 0 pA; P <0, 0001 v primerjavi z izhodiščem; P = 0, 0222 v primerjavi s TTX, n = 8; ponovljena meritev enosmerne ANOVA). ( h ) Vzorčni sledovi kažejo učinke optične stimulacije na izgorevanje LH nevronov. ( i, j ) na oPSC picrotoxin ne vpliva, vendar ga DNQX močno inhibira (izhodiščna vrednost: 90, 7 ± 12, 6 pA, picro: 115, 1 ± 17, 6 pA, DNQX: 11, 3 ± 3, 5 pA, n = 6; izhodišče v primerjavi z DNQX, P = 0, 0007; večkratno enosmerno ANOVA). ( k ) Trenutni posnetki sponk LH nevronov razkrivajo dva elektrofiziološka profila. Celice, prikazane s sivim kvadratom, ne kažejo sinaptičnih odzivov na modre svetlobne impulze; modri krog označuje celice s sinaptičnimi odzivi. ( l ) Akcijsko razmerje med potencialno frekvenco in odzivnimi celicami ( n = 16; P <0, 0001; dvosmerna ANOVA). ( m ) diferencialna hiperpolarizacija, „progiba“ med skupinami (neodzivni: 0, 017 ± 0, 024, n = 8; odzivnik: 0, 146 ± 0, 022, n = 8; P = 0, 0016; t- test). Izračun indeksa sag: (Vm max - Vm stacionarnega stanja) / Vm max, kot odgovor na stopnjo hipopolarizacije –80 pA). ( n ) Frekvenca vžiga (+60 pA korak) glede na indeks sag v odzivnih celicah in neodzivnih celicah. Lestvice: ( b ) in ( f ), 50 μm; ( g ) in ( i ), 50 pA in 10 ms; ( h ) in ( k ), 50 mV in 50 ms; NS, ni pomembno; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001; Vrstice napak, ± sem

Slika v polni velikosti

Vedenjski profili po stresu so občutljivi na kontekst

Organizacija vedenja v organiziran repertoar po stresu kaže na trdoživno prirojeno strategijo. Vendar pa mora biti ta strategija občutljiva na spremembe v okolju živali. Za preizkušanje te ideje smo izvedli poskuse, v katerih so miši prejeli nožni udarec in jih nato namestili v novo okolje (roman) ali opazili v komoro stopal za nogo (slika 5a). Podatke o vedenju so primerjali z živalmi, ki so jih po stopalu prenesli v HC (slika 1). V novem okolju je bilo očitno vseh osem vedenj (slika 5b), toda v primerjavi s HC je prišlo do zmanjšanja negovanja (sl. 5c – e, dopolnilna slika 10a, b in dodatni film 4) in narašča pri vzreji (slika 5f – h) in hoji (slika 5i – k). Nato smo ocenili časovne značilnosti teh vedenj. Čeprav ni bilo razlik v porazdelitvi negovanja v primerjavi s HC, (dodatna slika 10d) sta bila vzreja in hoja daljši čas (dodatna slika 10e, f) v celotnem obdobju opazovanja. Miške, vzdrževane v kletki za stopalo (FS), so pokazale robustno zamrzovanje takoj po stopalu (Sl. 5 l – n, dopolnilna slika 10 g in dodatni film 5). Ko se je to vedenje postopoma razblinilo, je pri hoji prišlo do povečanja (slika 5i – k in dodatna slika 10f). V nožni komori je bilo manj vzreje (slika 5f – h) in negovanja (slika 5c – e). Ta opažanja kažejo, da okolje močno vpliva na vedenjski vzorec po stresu in namiguje na osnovne razlike v strategiji, ki jih je sprejela žival, pri usklajevanju svoje vedenjske palete s kontekstom.

Image

( a ) Shema eksperimenta, ki prikazuje dva različna okolja, nov kontekst (roman) in komoro stopal (FS) takoj po stopalu. ( b ) Podrobna analiza prikazuje vzorec vedenj, ki jih živali prikazujejo v različnih okoliščinah. Vsaka vrstica predstavlja eno žival. Različna okolja spreminjajo vedenjski vzorec, ki ga izraža žival. ( c ) Odstotek živali, ki negujejo živali ob vsaki časovni točki. ( d ) Kumulativni grafi prikazujejo relativno negovanje v različnih okoliščinah, vključno z domačo kletko (HC) takoj po stresu, in v primerjavi z naivnimi miši (slika 1). ( e ) V HC je prevladujoča konjušnica (črtkana črta predstavlja povprečni čas negovanja v HC; Novel: 85, 1 ± 8, 0 s; FS: 49, 3 ± 9, 4 s; Novost v primerjavi s HC P <0, 0001; FS v primerjavi s HC P <0, 0001; n = 9 v vsaki skupini; enosmerna ANOVA). ( f ) Odstotek živali v vsaki časovni točki. ( g ) Kumulativni grafi prikazujejo relativno količino vzreje v različnih okoliščinah, vključno s HC takoj po stresu in naivnimi miši (slika 1). ( h ) Miške porabijo več časa za rejo v noveli (črtkana črta predstavlja povprečni čas gojenja v HC; Novel: 120, 4 ± 16, 0 s; FS: 18, 3 ± 8, 5 s; Novel v primerjavi s HC P = 0, 0097; Novel v primerjavi s FS P <0, 0001; n = 9 v vsaki skupini; enosmerna ANOVA). ( i ) Odstotek živali, ki hodijo ob vsaki časovni točki. ( j ) Kumulativni grafi prikazujejo relativni čas hoje v različnih okoliščinah, vključno s HC takoj po stresu in pri naivnih miših (slika 1). ( k ) Miši porabijo toliko časa, ko hodijo po noveli in FS (črtkana črta predstavlja povprečni čas hoje v HC; roman: 436, 7 ± 25, 2 s; FS: 405, 6 ± 41, 7 s; roman proti HC P <0, 0001; FS proti HC P <0.0001; n = 9 v vsaki skupini; enosmerna ANOVA). ( l ) Odstotek živali, ki zamrznejo ob vsaki časovni točki. ( m ) Kumulativni grafi ponazarjajo relativno zamrzovanje v različnih okoliščinah, vključno s HC takoj po stresu in naivnimi miši (slika 1). ( n ) Zmogljivost zamrzovanja je bila pomembna le v FS (pikčasta črta predstavlja povprečni čas zamrzovanja v HC; Novel: 19, 5 ± 3, 0 s; FS: 121, 8 ± 32, 0 s; Novost v primerjavi s FS P = 0, 0021; FS v primerjavi s HC P = 0, 0004; n = 9 v vsaki skupini; enosmerna ANOVA). Lestvice: ( c, d, f, g, i, j, l, m ), 20%; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001; Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

Kontekst vpliva na vedenja, ki jih poganja PVN CRH fotoaktivacija

Nato smo ocenili vpliv okolja na vedenja, opažena po fotoaktivaciji PVN CRH nevronov. Fotostimulirali smo PVN CRH nevrone v novem okolju (Novel) in prečniku (v nadaljevanju stopal) pri miših CRH eYFP in CRH ChR2 . Fotostimulacija je v novem okolju (slika 6a-c) in v stopalnici za noge (slika 6d-f) povečala negovanje (slika 6d-f). Nato smo preizkusili, ali vedenjski repertoar kot odgovor na optično stimulacijo modulira okoljska seznanjenost s primerjanjem vedenja miši v novih kletkah in kletkah, v katerih so bile naseljene. Optično sproženi čas negovanja se je postopoma zmanjšal, ko se je domnevna stopnja ogroženosti zvišala (slika 6g, h), vendar je bila porazdelitev časa za nego nespremenjena (dodatna slika 11a). Zanesljivo zmanjševanje vedenja med negovalnim vodenjem od nove do dvoranske noge kaže na to, da je večje poznavanje okolja verjetno pozitiven signal za negovalno vedenje. Da bi preizkusili to idejo, smo izvedli poskuse na dveh skupinah miši. V prvi skupini smo miši naselili tako, da smo jih vsakega od petih zaporednih dni izpostavili preskusni komori. V drugi skupini miši niso bile izpostavljene v komori. Obe skupini sta bili nato uvedeni v komoro, negovanje je bilo količinsko opredeljeno kot odziv na oddajanje modre svetlobe na vsakega od petih zaporednih dni (slika 6i). Živali s HAB niso pokazale sprememb v skupni prevoženi razdalji (slika 6j in dodatna slika 11b) ali v času nege (slika 6k in dodatna slika 11c) kot odgovor na fotostimulacijo. Nasprotno je pri živalih, ki niso HAB, pri vseh naslednjih petih dneh prišlo do zmanjšanja skupne prevožene razdalje (slika 6j in dodatna slika 11b) in povečanja negovanja (slika 6k in dodatna slika 11c). Miševe CRH eYFP so pokazale le nepomembne stopnje nege v obeh pogojih (dopolnilna slika 11d). Ta opažanja kažejo, da zaznana okolica pozitivno vpliva na vedenje, ki ga vodi PVN CRH.

Image

( a - h ) enak protokol oddajanja svetlobe (10 hz za 5 min), ki se uporablja v novem okolju (novela) in v FS takoj po napetosti stopal. ( a - c ) Fotostimulacija nevronov PVN CRH v noveli. ( a ) Vsaka vrstica predstavlja posamezno žival. ( b ) histogram, ki prikazuje odstotek nege živali. ( c ) Kvantifikacija nege v noveli (CRH eYFP : 8, 9 ± 1, 2 s, n = 10; v primerjavi s CRH ChR2 : 85, 0 ± 10, 9 s, n = 10; P <0, 0001; t- test). ( d - f ) Optična stimulacija nevronov PVN CRH v FS. ( d ) Vsaka vrstica predstavlja posamezno žival. ( e ) histogram, ki prikazuje odstotek negovanja živali. ( f ) Kvantifikacija nege v FS (CRH eYFP : 6, 4 ± 2, 5 s, n = 10; v primerjavi s CRH ChR2 : 40, 1 ± 9, 5 s, n = 10; P = 0, 0031; t- test). ( g ) Kumulativni grafi ponazarjajo relativni učinek različnih kontekstov na optično evocirano nego, vključno z nastalim (HAB) kontekstom (podatki prikazani na sliki 3). ( h ) Optično sproženi čas negovanja se postopoma zmanjšuje, ko se domnevna stopnja grožnje v kontekstu poveča (Novost: 74, 7 ± 7, 9% HAB, P = 0, 0405 v primerjavi s HAB; FS: 35, 8 ± 8, 3% HAB, P = 0, 0013 v primerjavi s HAB, P = 0, 0006 v primerjavi z novelo; n = 10; večkratno merjenje enosmerno ANOVA). ( i ) Shema eksperimenta, ki prikazuje učinke navade na negovanje, ki ga povzroča ChR2. ( j ) Povečana seznanjenost s paradigmo povzroči zmanjšanje izhodiščne lokomotične razdalje v areni v ne-HAB (5. dan: 45, 79 ± 10, 78% prvega dne, n = 11; P = 0, 0004 v primerjavi s 1. dnem; seznanjeni t- test ), vendar ne pri živalih HAB (dan 5: 85, 13 ± 10, 62% prvega dne, n = 5; P = 0, 21 v primerjavi s prvim dnem, seznanjeni t- test; P = 0, 0431 v primerjavi z ne-HAB, t- test). ( k ) Pri miših, ki niso HAB, je peti dan daljši optično povzročen čas (dan 5: 189, 6 ± 27, 8% v primerjavi s prvim dnem, n = 11; P = 0, 0016; seznanjeni t- test). V nasprotju s tem HAB živali kažejo invariantno odzivnost na optično aktivacijo (5. dan: 88, 5 ± 7, 7% v primerjavi s prvim dnevom; n = 5, P = 0, 323 v primerjavi z dnevom 1, seznanjeni t- test; P = 0, 0316 v primerjavi z ne-HAB, t- testom ). Lestvice: ( b, e, g ), 20%; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 0005; **** P <0, 0001. Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

Fotoaktivacija PVN CRH izklopi ustrezno vedenje v kontekstu

Na koncu smo vprašali, ali je odnos med okoljem in vedenjem, opažen kot odziv na stimulacijo PVN CRH nevronov, vzajemno moduliran. Z drugimi besedami, ali bi lahko usmerila aktivacijo PVN CRH nevronov čez prekomerno okolje? Tu smo primerjali prevladujoče vedenje v novem okolju in stopinjah pri živalih CRH eYFP in CRH ChR2 kot odgovor na fotostimulacijo. Fotostimulacija je zmanjšala rejo v novem okolju (slika 7a-d in dodatna slika 12a-d) ter zmrzovanje v stopalnici za noge (slika 7e-h in dodatna slika 12e-h). Nato smo vprašali, ali je ta okoljska sposobnost prekomerne vožnje nevronov CRH omejena na vedenje, ki smo ga opisali, ali to namiguje na širšo vlogo PVN CRH nevronov. Da bi preizkusili to zamisel, smo ocenili učinke fotostimulacije CRH v dveh široko uporabljanih vedenjskih testih, odprtem polju in prepoznavanju novega predmeta. V odprtem polju so miši CRH ChR2 preživele manj časa v središču odprtega polja v 5-minutnem obdobju fotostimulacije (sl. 7i), vendar gibanje ni vplivalo (dopolnilna slika 12i). Nato smo vprašali, ali bi aktiviranje PVN CRH nevronov motilo novo raziskovalno vedenje (slika 7j). V 5-minutnem obdobju opazovanja je bilo naravno raziskovanje novega predmeta praktično odpravljeno, ko so CRH nevroni fotostimulirani (slika 7k, l). Ta opažanja kažejo, da PVN CRH nevroni zmanjšujejo občutljivost miši na kontekstne navidezne znake. V tem času se miši zatečejo k nežno usmerjenim negovalnim dejavnostim, namesto da bi pokazale vedenjske vzorce, ki so skladni z ukvarjanjem z njihovim okoljem.

Image

( a - d ) Optična stimulacija nevronov PVN CRH zmanjšuje vzrejo v novem okolju (roman). ( a ) Vsaka vrstica predstavlja posamezno žival. ( b ) Histogrami, ki prikazujejo odstotek rej živali. ( c ) Kumulativni grafi prikazujejo relativni obseg reje. ( d ) Čas gojenja kot del vsega vedenja po izključitvi časa, porabljenega za nego (CRH eYFP : 13, 6 ± 1, 4%, n = 10; v primerjavi s CRH ChR2 : 9, 2 ± 0, 9%, n = 10; P = 0, 0165; t- test ). ( e - h ) Optična stimulacija nevronov PVN CRH moti zamrzovanje v FS. ( e ) Vsaka vrstica predstavlja posamezno žival. ( f ) Histogrami prikazujejo odstotek zamrznitve živali. ( g ) Kumulativni grafi prikazujejo relativni obseg zamrzovanja. ( h ) Kvantifikacija delnega časa zamrzovanja, če je čas, ki ga porabi čas za nego, izključen iz analize (CRH eYFP : 32, 5 ± 5, 7%, n = 10; v primerjavi s CRH ChR2 : 15, 8 ± 3, 8%, n = 10; P = 0, 0251; t- test ). ( i ) Ocena premikanja v testu na prostem. Reprezentativni parceli gibanja lokomotorne poti med optično stimulacijo pri miših CRH eYFP (črne) in CRH ChR2 (modre). Priloženi graf prikazuje, da miši CRH ChR2 preživijo bistveno manj časa, preživetega v osrednjem območju med fotostimulacijo (CRH eYFP : pred: 3, 9 ± 0, 5%, med: 6, 1 ± 0, 5%. Po: 6, 6 ± 0, 9, n = 16; v primerjavi s CRH ChR2 : pred : 4, 3 ± 1, 0%, med: 3, 3 ± 0, 8%, po: 5, 3 ± 0, 8%, n = 14; CRH eYFP med CRH ChR2 med, P = 0, 0291; dvostranska ponovna meritev ANOVA). ( j ) Reprezentativne ploskve gibanja lokomotorne poti med optično stimulacijo pri miših CRH eYFP (črne) in CRH ChR2 (modre) v novem testu (zelena oblika). Optična stimulacija zmanjša raziskovanje novega predmeta, merjeno z zakasnitvijo na dotik ( k, CRH eYFP : 127, 7 ± 36, 4 s, n = 6; v primerjavi s CRH ChR2 : 259, 0 ± 35, 2 s, n = 6; P = 0, 0267; t- test ) in čas, porabljen v neposredni bližini ( l, CRH eYFP : 21, 2 ± 7, 6 s, n = 6; v primerjavi s CRH ChR2 : 3, 0 ± 2, 8 s, n = 6; P = 0, 0494; t- test). Lestvice: ( b, c, f, g ), 20%; * P <0, 05; Vrstice napak ± sem

Slika v polni velikosti

Diskusija

Akutni stres zahteva takojšen vedenjski in fiziološki odziv 1, 2 . Tu smo združili celično specifično optogenetsko ciljanje z oceno več vedenj in pokazali, da PVN CRH nevroni orkestrirajo kompleksen repertoar vedenj po akutnem stresu. Ta vedenjski repertoar ne potrebuje endokrinega signalizacije, temveč se opira na vznemirljivo, glutamatergično projekcijo na podskupino nevronov v periforničnem območju LH. Čeprav je to vedenje izredno občutljivo na okoljski kontekst, lahko selektivna aktivacija CRH nevronov prekomerno vpliva na okolje, kar ima za posledico vedenja, ki se ne ujemajo s kontekstom. Te ugotovitve zagotavljajo nov okvir za oceno vedenja po stresu in kažejo, da živali razgradijo svoje vedenje po stresu v točno določenem vzorcu, na katerega vplivajo okolje in aktivnost nevronov PVN CRH.

PVN CRH nevroni se obravnavajo kot kanonični endokrini regulatorji stresnega odziva 12, lahko pa tudi uravnavajo kompleksno vedenje po stresu 16 . Eno najbolj dobro preučenih vedenj po stresu je negovanje 7 in v skladu s prejšnjimi ugotovitvami smo opazili zanesljivo povečanje negovanja po stresu. Grooming pa je bilo eno od osmih različnih vedenj, ki smo jih količinsko opredelili. Pri naivnih živalih je bilo to vedenje spontano (torej brez zunanjih dražljajev) z jasno pristranskostjo do raziskovanja okolja HC. Po stresu je prišlo do nenadne reorganizacije obstoječih vedenj in občutne prerazporeditve časa, porabljenega za specifična vedenja. Poleg povečanja nošenja so se povečala tudi hoja in reja. Ta raziskovalna vedenja so bila očitna že v obdobju opazovanja, vendar so v nekaj minutah zamrla, kar kaže, da lahko igrajo vlogo pri oceni grožnje po stresnem dogodku 5 . Čeprav so se po stresu povečala vsa tri vedenja, je fotoinhibicija CRH nevronov selektivno zmanjšala negovanje in povečala vzrejo in hojo. Medtem fotoaktivacija PVN CRH nevronov v odsotnosti stresa ni posnemala vedenja, opaženega po stresu, temveč je povečala negovanje in zmanjšala vzrejo in hojo. Skupaj ta opažanja kažejo, da lahko odstrel nevronov PVN CRH, če ni takojšnjega stresa, zmanjša vedenje, povezano z oceno tveganja, v korist vedenj, ki so usmerjena samostojno. V skladu s to idejo je rekrutiranje teh celic celo v okoljih, ki zahtevajo večjo budnost (novo okolje, FS komora) povečala negovanje, kar kaže na to, da so PVN CRH nevroni pomembni pri usklajevanju ustreznega vedenja z okoljem.

Optično novačenje CRH nevronov je povečalo kroženje CORT-a, vendar posnetki ex vivo kažejo, da aksoni teh celic sproščajo glutamat v sinapsah v periforničnem območju LH. Naše dvojno retrogradno označevanje kaže, da je subpopulacija celic v PVN projektih na obe tarči skladna s prejšnjim poročilom, da nevroendokrini CRH nevroni pošiljajo razvejane kolaterale v sosednja hipotalamična področja 15 ; it is unclear whether double-labelling of some, but not all, CRH neurons represents an under-sampling of the population because of technical limitations, or whether this suggests that information from a seemingly homogenous population of neurons can be routed to different targets depending on the information being conveyed 29 . Our findings that PVN CRH neurons control behaviour independent of their ability to release hormone, CRH is consistent with previous work demonstrating that CRF knockout mice have a normal grooming following stress 30 . This adds to the growing body of work demonstrating that putative collaterals from neuroendocrine cell populations in the hypothalamus can modulate behaviour 31, 32, 33 ; importantly, we provide one of the first demonstrations that presumptive neuroendocrine cells not only modify, but also drive behaviour selection. This may be part of a larger theme suggesting that hypothalamic circuits participate in behaviours that extend beyond those that are strictly need based or homeostatic 34 . Indeed, it appears that the hypothalamus exerts a bottom up control of complex behaviours 35, 36, 37 and that the CRH neurons play an essential role in shifting behavioural attention away from the environment and towards behaviours that are more internally focused.

Recent efforts to establish causal links between behaviour and underlying neural substrates have been extremely fruitful; here we further these efforts but with an important distinction. Rather than examining a single behaviour in isolation, we took an approach built on observations made by early behaviouralists who commented on individual behaviours as one component of a more complex pattern or ethogram of behaviours in the animal's natural environment 11 . In some aspects, the behavioural ethogram we describe is a broader representation of microstructure of individual behaviours that has recently been demonstrated 38 . These authors conclude that the individual elements of a given behaviour represent a library of physical motifs that can be re-purposed and re-sequenced to generate distinct behaviours. As we did not observe any 'new' behaviours after stress, we would put forward a similar analogy here suggesting that individual behavioural traits are indeed re-purposed into more complex behavioural programmes. Our observations provide evidence for a distinct ethogram following stress that is controlled by PVN CRH neurons. This ethogram is exquisitely sensitive to environment, but this sensitivity is muted by activation of PVN CRH neurons.

New insights gained from approaches that establish causal links between innate behaviour and neural circuits are an important step in furthering our understanding of how the brain controls complex behaviour in a changing environment. They also set the stage for further explorations that use circuit-based approaches to better understand neurodevelopmental and psychiatric disorders 39 . By pinpointing an essential node in the brain for controlling behaviours immediately after an acute stress, our observations provide a new model that can be exploited to better understand the circuit function/dysfunction underlying stress disorders. For example, increased arousal and hypervigilance that persist after a traumatic event could be a consequence of rapid decreases in PVN CRH activity after stress. By contrast, the ability of PVN CRH neurons to dampen the impact of environmental cues suggests that increased activity in this cell population may contribute to stereotyped behaviours linked to psychiatric and neurodevelopmental disorders in which individuals eschew their environmental context and turn their focus towards self-directed or internally focused behaviours. Specifically, intense inward focus is a core feature in autism spectrum disorder, depression and anxiety. In each of these conditions, patients exhibit internally focused behaviours ranging from stereotypies to ruminations to negative thinking. Strikingly, repetitive stereotyped behaviours, particularly following exposure to stressful situations are a cardinal feature of autism spectrum disorder 10 . Recent animal models have directed attention towards the amygdala as a key structure that controls the balance between social and stereotyped behaviour 40, 41, but our findings would suggest an expanded model that incorporates PVN CRH neurons in regulating these behaviours, specifically after stress, is warranted.

Metode

Živali

All experiments were approved by the University of Calgary Animal Care and Use Committee in accordance with Canadian Council on Animal Care guidelines. Crh-IRES-Cre ( B6(Cg)-Crhtm1(cre)Zjh/J ; stock number 012704) and Ai14 ( B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-TdTomato)Hze/J ; stock number 007914) mice, whose generation has been detailed previously 42, 43, were obtained from Jackson laboratories. Colony maintenance and genotyping was carried out as described previously 17 . For experiments, Crh-IRES-Cre +/+ mice and offspring derived from crosses of homozygous Crh-IRES-Cre and Ai14 genotypes were used. Until the first procedure mice were group-housed, then single-housed on a 12:12 h light/dark schedule (lights on at 07:00 hours) with ad libitum access to food and water.

Injection and implantation

In a stereotaxic apparatus under isoflurane anaesthesia, glass capillaries were lowered into the brain of 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice (anteroposterior (AP), −0.7 mm; lateral (L), −0.3 mm from the bregma; dorsoventral (DV), −4.5 mm from the dura). Recombinant adeno-associated virus (AAV) carrying ChR2-eYFP (Addgene plasmid 20298, pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core), eYFP (Addgene plasmid 20296, pAAV-EF1a-double floxed-eYFP-WPRE-HGHpA; 5 × 10 11 GC per ml; Penn Vector Core) or Arch3.0-eYFP (rAAV2-EF1a-double floxed-eArch3.0-eYFP; 5 × 10 11 GC per ml; UNC Vector Core) was pressure injected with Nanoject II apparatus (Drummond Scientific Company) in a total volume of 210 nl. Mice were allowed to recover at least 14 days before further experiments. For in vivo optogenetic experiments, mono fiberoptic cannulas (Doric Lenses) were stereotactically implanted under similar conditions (for Arch3.0: AP, −0.7 mm; L, 0.0 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura, for ChR2 AP, −0.7 mm; L, −0.3 mm from the bregma; DV, −4.0 mm from the dura; for LH stimulation: AP, −1.2 mm L, −1.0 mm from the bregma; DV, −4.2 from the dura). Animals were allowed to recover for a week and handled ca 5 min daily for 4 consecutive days before all behavioural testing.

For neural tracing experiments, 6- to 8-week-old Crh-IRES-Cre ; Ai14 mice were pressure injected with green retrobeads (Lumafluor) as described above (AP, −1.2 mm; L, −1.0 mm from the bregma; DV, −5.2 mm from the dura) in a total volume of 32 nl. One week later, mice received 100 μl ml −1 of fluorogold (4 mg ml -1 ; Fluorochrome) injection iv Mice were killed and processed for immunohistochemistry after one additional week.

Slice preparation and electrophysiology

Three to five weeks post AAV-injection, mice were anaesthetized via isoflurane inhalation and decapitated. Rapidly dissected brains were immersed in slicing solution (0–4 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 25 D -glucose, 1.25 NaH 2 PO 4, 75 sucrose. A vibratome (Leica) was used to prepared coronal hypothalamic slices (250 μm thickness), which were transferred for 1+hours before recording in artificial cerebrospinal fluid (32 °C, 95% O 2 /5% CO 2 saturated) containing (in mM): 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.5 MgCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4, 10 glucose. Recordings were performed in artificial cerebrospinal fluid (1 ml min −1 perfusion) at 30–32 °C. The following drugs were applied via perfusion pump: DNQX (10 μM, Tocris), picrotoxin (100 μM, Sigma), 4-aminopyridine (4-AP, 500 μM, Tocris) and tetrodotoxin (TTX) (1 μM, Tocris). PVN/LH neurons were identified using differential interference contrast and epifluorescence optics (UVICO, Rapp Optoelectronics) and a camera (AxioCam MRm) on an upright microscope (Zeiss). Borosilicate electrodes (3–5 mΩ tip) were backfilled with recording solution composed of (in mM) 108 K-gluconate, 2 MgCl 2, 8 Na-gluconate, 8 KCl, 1 K 2 -EGTA, 4 K 2 -ATP, 0.3 Na 3 -GTP, 10 mM HEPES, 10 mg ml −1 biocytin. Signals were amplified (Multiclamp 700B, Molecular Devices), low-pass filtered (1 kHz), digitized (10 kHz, Digidata 1322) and recorded (pClamp 9.2) for offline analysis. After recordings, slices were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA; 24 h), incubated with streptavidin-A555 (1:500) and cleared in 50:50 glycerol/tris-buffered saline (TBS), before mounting and confocal imaging.

Optogenetics

For in vitro recordings, a micromanipulator-attached fibre optic cable (105 μm core diameter) delivered light from a laser (for ChR2: 473 nm, OptoGeni 473, IkeCool Corporation; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was placed 1–2 mm away from the target area. Light intensity was calibrated by a Photodiode Power Sensor (Thorlabs). Maximally, 2.5 or 15 mW light (for ChR2 or Arch3.0, respectively) was delivered to the tissue.

For in vivo experiments, the light source (for ChR2: 473 nm, LRS-0473-GFM, Laserglow Technologies; for Arch3.0: 593 nm, IKE-593-100-OP, IkeCool Corporation) was connected to the implanted ferrule with a fibre optic cable (200 μm core diameter, Doric Lenses). The lasers were controlled with a manually programmable Master 8 unit (AMPI).

Behavioural assessment

Wild-type mice received a series of footshocks (0.5 mA for 2 s, ten times in 5 min; SMSCK, Kinder Scientific) and their activity was video-recorded for 15 min in the footshock chamber, in a novel environment or in the HC immediately after the footshock. For in vivo optogenetics experiments, mice were handled the 4 days preceding behavioural assessment. Blue light was delivered for 5 min (10 Hz, 10 ms pulse width, 15 mW; 473 nm); in LH stimulation experiments, 20 Hz was used. Yellow light (15 mW) was delivered continuously for 15 or 5 min. Behavioural video analysis was conducted by an individual blinded to subject treatment group using a macro in Microsoft Excel. Walking was noted as the animal changed its location or turned as long as the front paws moved. Freezing behaviour was noted if animal showed no movement for at least 3 s, except respiratory movements.

For c-Fos immunolabelling, animals were killed 2 h after light stimulation. For experiments with Arch3.0, after recovery mice were handled for 4 days and HAB to the experimental condition for 3 additional days. After a similar series of footshock, their behaviour was recorded in their HC under continuous yellow light (15 mW) for 15 min. For assessing the involvement of circulating CORT, metyrapone (75 mg per kg, Tocris Bioscience, dissolved in 50 μl polyethylene glycol) was administered ip 60 min before footshock. For circulating CORT level measurements, baseline blood samples were taken from the tail vein at least 2 h before light stimulation. Second sampling was done 15 min after the onset of light stimulation. CORT level was measured using an ELISA kit (Arbor Assays). To investigate social cues bedding was not replaced in the HC of mice for 10 days prior testing. Experiment subjects were at the age of 16 weeks while conspecific males were 7 weeks old.

Imunohistokemija

To prepare fixed brain tissue, mice were anaesthetized with sodium pentobarbital (30 mg kg −1 ) and transcardially perfused with phosphate-buffered saline, followed by 4% PFA in phosphate buffer (4 °C). Brains were placed in PFA 24 h followed by 20% sucrose phosphate buffer. 30 μM coronal brain sections were obtained via cryostat in three series. Rinses were performed before/between incubations with TBS containing triton (TBSt; pH 7.4, with 0.1% Triton X-100), blocking solution (5% normal donkey serum in TBSt) was pre-applied for 1 h and used in subsequent antibody incubations. Rabbit anti-c-Fos Ab5 (1:10, 000 dilution; overnight at room temperature; Calbiochem) primary antibody or rabbit anti-fluorogold (1:10, 000, overnight at room temperature; Chemicon) was used. For fluorogold and c-Fos labelling, biotinylated donkey anti-rabbit secondary antibody (1:500; Jackson ImmunoResearch) and DyLight-405-conjugated streptavidin were used (1:500; Jackson ImmunoResearch) in Crh-IRES-Cre;Ai14 animals, whereas in Crh-IRES-Cre animals, Alexa-555-conjugated donkey anti-rabbit (1:500; Molecular Probes) was utilized. Slide-mounted and coverslipped sections were imaged using a confocal microscope (Olympus BX50 Fluoview and Nikon D-Eclipse C1). For c-Fos assessment, we included the entire rostral-caudal extent of one side of the PVN and the region around the fornix. Immunolabelled nuclei were counted using ImageJ.

Analysis and statistics

Where quantification was made, data are represented as mean±standard error of the mean (sem). Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 6 using paired and unpaired Student's t -test to for two group comparisons, whereas repeated measures one-way and two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparison post-hoc test for sequential treatment data. P values less than 0.05 were considered significant.

Razpoložljivost podatkov

The data that support the findings of this study are available from the corresponding author upon request.

Dodatne informacije

How to cite this article: Füzesi, T. et al. Hypothalamic CRH neurons orchestrate complex behaviours after stress. Nat. Commun. 7:11937 doi: 10.1038/ncomms11937 (2016).

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Supplementary Figures 1-12

Videoposnetki

  1. 1.

    Dopolnilni film 1

    Behavior of CRHeYFP control mice after stress

  2. 2

    Dopolnilni film 2

    Photoinhibition of PVN CRH neurons disrupts behavioral repertoire after stress

  3. 3.

    Dopolnilni film 3

    Photostimulation of PVN CRH Neurons initiate grooming

  4. 4.

    Dopolnilni film 4

    Behavior in novel environment after stress exposure

  5. 5.

    Dopolnilni film 5

    Behavior in unsafe environment after stress exposure

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.