Genska karakterizacija dveh velikih alu posredovanih preureditev gena brca1 | časopis za človeško genetiko

Genska karakterizacija dveh velikih alu posredovanih preureditev gena brca1 | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Homološka rekombinacija
  • Mutageneza
  • Mutacija

Izvleček

Da bi ugotovili, ali je velika genomska preureditev dejansko nova, in da bi dobili vpogled v mutacijski mehanizem, ki je odgovoren za njen nastanek, je molekularna karakterizacija z identifikacijo prelomne točke obvezna. Tukaj poročamo o karakterizaciji dveh velikih izbrisov, ki vključujejo gen BRCA1 . Prva preureditev je imela delecijo 89 664-bp, ki je vsebovala ekson 7 gena BRCA1 do eksona 11 gena NBR1 (c.441 + 1724_o NBR1 : c.1073 + 480del). V genomskih sekvencah, ki obdajajo mejne točke brisanja, smo našli dva zelo homologna Alu elementa. Nadalje je bilo opaziti 20-bp zaporedje prekrivanja na stičišču preloma, kar kaže, da je bil najverjetnejši mehanizem za pojav te preureditve nealelična homologna rekombinacija. Druga preureditev, ki je bila v celoti značilna na ravni nukleotidov, je bila delecija BRCA1, ki je bila eksona 11–15 (c.671-319_4677-578delinsAlu). Zadeva je zakrila izbris 233-bp z elementom Alu, vstavljenim na prelomnih točkah izbrisanega območja. Ker vstavljeni element Alu pripada še vedno aktivni družini AluY, bi lahko opažena preureditev nastala zaradi mehanizma za brisanje, ki ga posreduje vstavljanje, ki ga povzroča Alu retrotransposition. Za zaključek opišemo meje dveh novih velikih izbrisov, ki vključujejo gen BRCA1, in analiza njihovega genomskega konteksta nam je omogočila vpogled v ustrezen mutacijski mehanizem.

Uvod

V dednih družinah raka dojk / jajčnikov (HBOC) je bilo ugotovljenih več sto različnih mutacij BRCA1 in BRCA2 , vključno z velikimi genomskimi preureditvami (LGR). Visoka vsebnost elementov Alu v introničnih zaporedjih genov BRCA1 in BRCA2 prispeva k pojavu preureditev v teh genih. 1, 2 Te genomske preureditve vključujejo predvsem brisanje in podvajanje enega ali več eksonov in predstavljajo 10–15% vseh škodljivih mutacij zarodnih vrst v genu BRCA1 in 1–7% v genu BRCA2 . 3, 4 Prispevek teh LGR-jev k družinam, pozitivno na mutacijo BRCA1 / 2, je odvisen od prebivalstva in v določenih etničnih skupinah so bile ugotovljene številne preureditve ustanoviteljev BRCA1 . 5, 6, 7 Po drugi strani je delež preureditev gena BRCA2 na splošno veliko manjši od deleža v genu BRCA1 , kar je mogoče razložiti z nižjo vsebnostjo ponavljajočih se sekvenc Alu v prvem v primerjavi s slednjim. Edina izjema od tega pravila je Portugalska, kjer ustanovitvena preureditev BRCA2 c.156_157insAlu (vstavitev Alu v exon 3 8 ) predstavlja več kot četrtino družin HBOC z škodljivimi mutacijami BRCA1 / BRCA2 in približno polovico tistih, ki imajo mutacije BRCA2 . 9

Za odkrivanje LGR-jev so potrebne posebne tehnike, na primer ojačanje sonde multipleksne ligacije (MLPA) ali kvantitativni PCR, ki dajejo le podatke o eksonični regiji, ki je vključena v preureditev, in ne o natančnih genskih mejnih točkah. Zato je mogoče podobno opisati preureditve z izrazitimi mejnimi točkami, ki vključujejo iste eksone, zato je težko oceniti, ali je določena preureditev nova ali celo specifična za določeno populacijo. 10 Da bi ugotovili, ali je LGR v resnici nov, in dobili vpogled v mutacijski mehanizem, ki je odgovoren za njegov nastanek, je molekularna karakterizacija z identifikacijo prelomne točke obvezna. Opisanih je bilo približno 81 ločenih LGR-jev BRCA1 , večina je bila brisanja, ki so jim sledile preureditve z vstavitvijo in izbrisom, podvajanja, ena vstavka in ena podvojenost. 4 Tu poročamo o karakterizaciji genskih mejnih točk dveh BRCA1 LGR, odkritih v portugalskih družinah HBOC, in sicer o izbrisu, ki vključuje BRCA1 , v bližnji gen NBR1 in intrageni izbris BRCA1 .

Rezultati

Karakterizacija BRCA1 izbrisov 1–7 brisanje

Analiza v kompletu MLPA P002 je pokazala genomsko brisanje, ki obsega BRCA1 eksone 1–7. Analiza z MLPA kitom P239 promocijske regije BRCA1 , ΨBRCA1 in NBR2 (eksoni 1, 3 in 5) ter geni NBR1 (ekson 3, 7 in 11) je pokazala, da so bili vsi ti predeli tudi izbrisani. Za analizo preostalih eksonov NBR1 smo izvedli delno kvantitativno multipleksno PCR metodo, ki sega od intra 11 do eksona 22 gena NBR1 . Vsi ti fragmenti NBR1 so vključevali SNP, ki hkrati postavljajo pod vprašaj njihov heterozigotični status (tabela 1). Rezultati so pokazali, da območje NBR1, ki obsega rs112693602 (intron 11 / ekson 12) do rs13119 (ekson 22), ni bilo izbrisano, kar je zožilo razdaljo do točke preloma. Po PCR na dolgi doseg z domnevenimi primeri , ki segajo v intron 7 gena BRCA1 in intron 11 gena NBR1 , smo v vzorcu s preureditvijo BRCA1 dobili fragment ∼ 1300 bp. Analiza zaporedja tega izdelka za PCR je pokazala, da je primer imel 89 664-bp brisanje, ki vsebuje ekson 7 gena BRCA1 do eksona 11 gena NBR1 , s 5 'in 3' prelomnimi točkami, nameščenimi 1724-bp predvodno od BRCA1 eksona 7 in 480-bp gorvodno od eksona 11 NBR1 , kar ustreza mutaciji BRCA1 c.441 + 1724_o NBR1 : c.1073 + 480del (slika 1). 5 'in 3' bočna območja preloma predstavljajo popolno zaporedje homologije 20 bp. V genomskih zaporedjih sta bila najdena dva elementa Alu, ki sta pri bočnih točkah brisanja izbrisana v intron 7 BRCA1 (AluSc) in intron 11 NBR1 (AluSg), poravnava zaporedja pa je pokazala, da sta ta dva elementa zelo homologna (slika 2a).

Image

Shema, ki predstavlja molekularno karakterizacijo BRCA1 c.441 + 1724_oNBR1: c.1073 + 480del in c.671-319_4677-578delinsAlu mutacij. ( a ) Genomsko območje, ki obsega gene NBR1 in BRCA1 , z izbrisanima območjema in z Alu elementoma, ki sta za obe mutaciji predstavljeni. ( b ) BRCA1 c.441 + 1724_oNBR1: c.1073 + 480del mutacija s 5 'in 3' prelomnimi točkami, ki se nahajajo v intrnu 7 in 11 BRCA1 oziroma NBR1 . Mejne točke za brisanje se mejijo z dvema elementoma AluSc / AluSg s celotnim homolognim zaporedjem 20 bp znotraj teh ponovitev Alu. ( c ) Zaporedni elektroforogram BRCA1 c.441 + 1724_oNBR1: c.1073 + 480del prelomno točko s poudarjenim zaporedjem prekrivanja. ( d ) BRCA1 c.671-319_4677-578delinsAlu mutacija, s prelomnimi točkami v uvodnih 10 in 15 gena BRCA1 in predstavlja vstavitev Alu. 5 'prelomna točka izbrisa je bila blizu elementa AluJb, medtem ko se je 3' prelomna točka zgodila v elementu AluY. ( e ) Zaporedni elektroforogram 5 'prelomnega območja BRCA1 c.671-319_4677-578delinsAlu, ki prikazuje raztezanje vstavljenega Alu elementa poli-A. Celotna barvna različica te številke je na voljo v spletni reviji Journal of Human Genetics .

Slika v polni velikosti

Image

Poravnava elementov Alu v preureditvah BRCA1. ( a ) Prilagoditev elementov Alu, vključenih v BRCA1 c.441 + 1724_oNBR1: c.1073 + 480del preureditev, in sicer AluSc v BRCA1 intron 7 (INT7) in AluSg v NBR1 intron 11 (INT11). ( b ) Poravnava elementov Alu, vključenih v BRCA1 c.671-319_4677-578delinsAlu preureditev, AluJb v intronu 10 BRCA1 (INT10), AluY v intronu 15 (INT15) in vstavljenem elementu Alu (vstavitev Alu). Vsaka pika stoji za isti nukleotid, črtice pa kažejo na vrzeli, da se poveča poravnava.

Slika v polni velikosti

Karakterizacija črtanja eksonov BRCA1 11–15

Identifikacija preloma brisanja BRCA1 eksonov 11–15 je temeljila na podatkih, pridobljenih s preučevanjem SNP-jev, ki se nahajajo v intronih 10 (rs7503154) in 15 (rs8176214, rs77152443 in rs72130855) gena BRCA1 . Označevalca rs7503154 in rs72130855 sta bila heterozigozna, kar pomeni, da ti regiji nista bili izbrisani. Označevalca rs8176214 in rs77152443 nista bila heterozigota, kar verjetno kaže na to, da se nahajata v izbrisanem območju. Po dolgoročnem PCR-ju s sprednjim osnovnim premazom markerja rs7503154 in obratnim osnovnim premazom markerja rs72130855 smo v vzorcu dobili prelomek ∼ 1100-bp s preureditvijo BRCA1 . Analiza zaporedja tega izdelka za PCR je pokazala, da je območje preloma v mutiranem alelu. Zadeva je vsebovala črtanje 233-bp, ki je vsebovala eksone 11–15 gena BRCA1 s 5 ′ in 3 ′ mejnimi točkami, nameščenimi 319-bp navzgor od eksona 11 in 578-bp navzgor od eksona 16 (slika 1). Poleg tega je bilo na prelomni točki brisanja vstavljeno zaporedje ∼ 250-bp (slika 1). Čeprav natančne dolžine ni bilo mogoče določiti zaradi prirojenih težav pri zaporedju dolgih traktov poly-A, je ta fragment vseboval ∼ 60-bp poly-A. Programska oprema Censor Server in RepeatMasker je pokazala, da je to zaporedje element Alu, ki pripada družini AluY, kar nam je omogočilo, da to preureditev opišemo kot BRCA1 c.671-319_4677-578delinsAlu. 5 'prelomna točka izbrisa je bila 120-bp navzdol od Alu elementa (AluJb), medtem ko se je 3' prelomna točka zgodila v drugem elementu Alu (AluY). Poravnava zaporedja treh Alu elementov, ki naj bi bili vključeni v to preureditev, je prikazana na sliki 2b. Vstavljena Alu sekvenca je pokazala višjo homologijo intron 15 prelomnega območja gena BRCA1 .

Diskusija

Glede na Sluiter in van Rensburg sta bila za gena BRCA1 in BRCA2 značilna 4 81 in 17 različnih LGR. Eden od mehanizmov, ki povzročajo večje preureditve genov pri ljudeh, vključuje elemente Alu, ki so retrotranspojivi vmesni ponavljajoči sekvence, ki uporabljajo L1 kodirano napravo za prenos in predstavljajo ∼ 10% človeškega genoma. 14 Alu sekvence sestavljajo tri glavne poddružine, in sicer J (najstarejša) in S (vmesna) poddružina, ki so odgovorne za veliko večino kopij Alu, ki so trenutno prisotne v človeškem genomu, in poddružina Y (najmlajša), ki je odgovorna za vse nedavno integriranih Alu sekvenc v človeškem genomu. 15, 16 Ta ponavljajoča zaporedja so odgovorna za ustvarjanje genske variacije in tudi človeških bolezni, ne samo zato, ker je znano, da Alu sekvence posredujejo pri pojavu genetskih rekombinacijskih dogodkov kot neposredni rezultat njihove številčnosti in homologije zaporedja, ampak tudi zaradi pojava vstavitvene mutacije kot posledice preusmeritve Alu. 17

Označili smo dve veliki deleciji, ki vključujeta gen BRCA1 , ki predstavljata približno 4% (2/48) vseh družin BRCA1 HBOC, identificiranih v naši populaciji. Prva preureditev, o kateri poročamo, je vsebovala črtanje, ki obsega ekson 7 gena BRCA1 do ekson 11 gena NBR1 (c.441 + 1724_o NBR1 : c.1073 + 480del). V genomskih zaporedih, ki se spopadajo z mejo brisanja brisanja, smo našli dva zelo homologna elementa Alu, in sicer AluSc v BRCA1 intron 7 in AluSg v intrnu NBR1 11. Poravnava teh intronskih zaporedij je nakazovala, da je najverjetnejši mehanizem za nastanek te preureditve ni bila homolelna homologna rekombinacija med temi ponovitvami Alu, podkrepljena s prisotnostjo 20-bp prekrivajočega se zaporedja na stičišču preloma. Predpostavljamo, da to zaporedje vsebuje rekombinogeno žarišče, kot je bilo predpostavljeno za druge sekvence v Alu elementih, kot je bilo tudi že predpostavljeno. 18, 19 Rüdiger et al. , 19 je nakazovalo, da so štiri različne preureditve gena za lipoprotein nizke gostote predstavljale skupno 26-bp zaporedje, ki deluje kot rekombinacijska vroča točka. To jedrno zaporedje vsebuje pentanukleotidni motiv (CCAGC), ki je tudi del chija, 8-bp zaporedja, za katerega je znano, da stimulira rekombinacijo, ki jo posreduje recBC, v Escherichia coli . 19 Primerjali smo 20-bp zaporedje prekrivanja z zaporedji, vključenimi v 81 preureditev BRCA1, ki sta jih opisala Sluiter in van Rensburg. 4 To 20-bp zaporedje smo opazili (do največ tri neusklajenosti, ne da bi to vplivalo na motiv pentanukleotida) na območju preloma v štirih preureditvah (NG_005905.2: g.114552_121641del, g.148011_151126del, g.153110_161767dup in g.166375_170153ins), ki podpirajo možnost, da so te preureditve povzročile določeno zaporedje z rekombinogeno naravo (slika 3). 4, 19 Vendar pa je to 20-bp zaporedje zelo ohranjeno, saj je prisotno v konsenzusnem zaporedju treh glavnih poddružin Alu (J, S in Y), kar samo po sebi lahko razloži visoko pojavnost homologne rekombinacije, ki vključuje te sekvence. 15 Izbris eksonov 1-7 gena BRCA1 je že prej opisal Engert in sod. , 20, vendar genomska prelomna točka ni bila določena. Vendar so s primerjalno gensko hibridizacijo potrdili, da je najmanjša velikost črtanja približno 200 kb, največja velikost pa približno 285 kb, ki zajema celotno območje NBR1 , zato lahko domnevamo, da je BRCA1 c.441 + 1724_o NBR1 : c.1073 + 480del, o katerem poročamo, je nova genomska preureditev. Ta BRCA1 LGR obsega še tri loke , in sicer NBR1 , ΨBRCA1 in NBR2 . ΨBRCA1 in NBR2 ni bila dodeljena nobena prepoznavna biološka funkcija, medtem ko gen NBR1 kodira zelo ohranjen protein z več domenami , ki sodeluje pri selektivni avtofagiji. 22 Poročana družina ne kaže nobene izrazite fenotipske lastnosti, razen nagnjenosti k rakom dojke in jajčnikov, kar kaže na to, da je ustrezna genetska napaka inaktivacija gena BRCA1 . Gad in sod. So izključili tudi sindrom izločanja genskih genov . , 23 v eni družini, ki predstavlja izbris BRCA1 eksonov 1–22, ki je zajel tudi gene NBR1 , ΨBRCA1 in NBR2 . Odsotnost mutacij v genih NBR1 in NBR2 pri bolnicah z rakom dojke in jajčnikov kaže tudi na to, da je inaktivacija BRCA1 ustrezna posledica tega LGR. 24, 25

Image

Ustrezne sekvence štirih različnih preureditev genov BRCA1 predstavljajo 20-bp zaporedje prekrivanja (sive barve) v bližini ali na območju preloma, o čemer smo že poročali. Genomske mejne točke (podčrtane) so bile pridobljene od Sluiterja in van Rensburga s pomočjo zapisa RefSeqGene, NG_005905.2. 4

Slika v polni velikosti

Druga preureditev v celoti značilna na ravni nukleotidov je bila mutacija BRCA1 c.671-319_4677-578delinsAlu, ki jo je naša skupina prej opisala kot EX11_15del. 11 3 'prelomna točka se je zgodila v elementu AluY in 5' prelomna točka je bila 120 bp navzdol od drugega Alu elementa (AluJb) v genu BRCA1 . Poleg tega je bil na prelomnih točkah izbrisanega območja vstavljen lu 250-bp Alu fragment. Ta Alu fragment predstavlja visoko homologijo intron 15 točke preloma gena BRCA1 in glede na programsko opremo Censor Server in RepeatMasker je to zaporedje element Alu, ki pripada družini AluY. Alu posredovana neenaka homološka rekombinacija je najpogostejši mehanizem, ki povzroča LGK BRCA1 . Tu opisani dogodek brisanja / vstavitve bi lahko bil posledica homologne rekombinacije z izmenjavo genskega materiala. 26 Druga možna razlaga za opaženo preureditev pa bi lahko vključevala mehanizem za brisanje, ki ga posreduje vstavitev, ki ga povzroči retrotranspozicija Alu elementov na tem genomskem mestu, kar vodi do izbrisa sosednjih genskih regij. 26, 27, 28, 29 To hipotezo potrjuje dejstvo, da vstavljeni element Alu pripada še vedno aktivni družini AluY. Obstaja le nekaj poročil o velikih izbrisih, ki jih povzroči retrotranspozicija elementa Alu: na primer o bolnikih z motnjo pomanjkanja lipoprotein lipaze, ki jih povzroča Alu retrotranspozicijski mehanizem 29 in TP53, so poročali o kompleksni preureditvi brisanja-vstavitve. pokazalo se je, da je gen preurejen s kompleksno preureditvijo, ki ima za posledico brisanje eksonov 2–4 z vstavitvijo okrnjenega fragmenta Alu. 26 V BRCA1 so poročali le o osem različnih preureditev brisanja-vstavitve, vendar nobenega ni mogoče pripisati mehanizmu retrotranspozicije, posredovanega z Alu, 4 zato bi bil to prvi opis takega mehanizma mutacije gena BRCA1 . Izbris eksonov 11–15 gena BRCA1 je opisal tudi de la Hoya in sod. ; 30 vendar sta mutacijski mehanizem in genska prelomna točka (L78833: g.33450_56562del) drugačna od tistih, o katerih poročamo, in poudarja pomen karakterizacije preloma, da se ugotovi, ali so preureditve, ki vključujejo iste eksone, povezane ali so se pojavile novo .

Za zaključek smo opredelili mejne točke dveh novih velikih izbrisov, ki vključujejo gen BRCA1 , ena pa vključuje tudi ekson 1–7 poleg dveh sosednjih genov NBR2 in NBR1 (c.441 + 1724_o NBR1 : c.1073 + 480del) in druga obsegajo eksone 11–15 (c.671-319_4677-578delinsAlu). Obe preureditvi sta najverjetneje posredovali Alu elementi, bodisi s homologno rekombinacijo med Alu ponovitvami bodisi z retrotranspozicijo Alu elementa.