Funkcionalna analiza gabarap 17.113.1 z knockdown zebrafish | časopis za človeško genetiko

Funkcionalna analiza gabarap 17.113.1 z knockdown zebrafish | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Nenormalnost kromosomov
  • Nevrorazvojne motnje

Izvleček

S primerjalno genomično hibridizacijo na osnovi matrike je bil ugotovljen 2, 3-Mb mikrodelement 17p13, 2p13, 1 pri dečku z zmerno mentalno zaostalostjo, nepopustljivo epilepsijo in dismorfnimi značilnostmi. To delecijsko območje se je prekrivalo s predhodno predlagano najkrajšo regijo, ki se je prekrila za mikrodelecijo 17p13.1 pri bolnikih z ugotovitvami možganske zaostalosti, mikrocefalijo, mikroretrognatijo in nenormalno magnetno resonanco (MRI) cerebralne bele snovi, v katero je vključenih vsaj 17 znanih genov . Med njimi imajo DLG4 / PSD95 , GPS2 , GABARAP in KCTD11 funkcijo pri razvoju nevronov. Zaradi funkcionalnega pomena smo bili pozorni na DLG4 / PSD95 in GABARAP ter analizirali zebrofis , pri katerem je bil homolog zelišč človeškega DLG4 / PSD95 in GABARAP podrt in ugotovili, da je spodbijanje gabarap povzročilo majhno glavo in hipoplastično čeljust. Ta ugotovitev bi bila podobna običajnim ugotovitvam bolnikov z izbrisom 17p13.1. Čeprav v DLG4 / PSD95 ali GABARAP v kohortni študiji s 142 bolniki z idiopatsko zamudo v razvoju z / brez epilepsije ni bilo patogenih mutacij, bodo potrebne dodatne študije za gene, vključene v to regijo.

Uvod

Za nevrorazvojne motnje so običajno značilni nevrološki simptomi, ki se pojavljajo v fazah hitrega razvoja živčnega sistema. Te motnje vključujejo številne simptome, vključno s kognitivnimi okvarami, ki lahko segajo od učne oviranosti do duševne zaostalosti, nevromotorne disfunkcije in motenj napadov. V post-genomski dobi je razpoložljivost zaporedja človeškega genoma za analizo na celotnem genomu pokazala veliko pogostost nevrorazvojnih motenj, ki ne izhajajo samo iz mutacij genomskega zaporedja, temveč tudi zaradi aberacij genskih kopij. 1

V zadnjem času je uporaba skeniranja celotnega genoma s primerljivo hibridizacijo na osnovi matrike (aCGH) omogočila natančnejšo razmejitev subtilnih kromosomskih preureditev. 2, 3, 4, 5 S pomočjo tega revolucionarnega citogenetskega testiranja je bilo značilno veliko novih sindromov mikrodelekcije in podvajanja; 6, 7, na primer, sindrom brisanja 1q41q42, sindrom brisanja 8 15q13.3, sindrom brisanja 9 16p11.2, sindrom brisanja 10, 11 17q12 12 in sindrom brisanja / podvajanja 17q21.31. 13, 14, 15 Kljub majhnosti v primerjavi z drugimi kromosomi je kromosom 17 povezan s številnimi na novo značilnimi genomskimi sindromi. Med človeškimi kromosomi v mnogih pogledih izstopa kromosom 17. Je največji človeški avtosom z ortologijo samo na enem mišjem kromosomu, ki se v celoti preslika na distalno polovico mišjega kromosoma 11. Kromosom 17 je bogat z geni, ki kodirajo beljakovine, ki imajo drugi največji gensko gostoto med človeškimi kromosomi. Obogaten je tudi s segmentarnimi podvajanji, s tretjimi gostoti med avtosomi. Zaradi tega je človeški kromosom 17 vpleten v najrazličnejše človeške bolezni. 16

Proksimalni 17p krak kromosoma, v katerem je> 23% genomskega zaporedja sestavljeno iz ponavljajočih se nizkih kopij, je povezan s široko paleto ponavljajočih se kromosomskih aberacij, ki so posledica nelelične homologne rekombinacije med ponavljajočimi se kopijami, vključno s štirimi dobro znanimi genomskimi motnjami : Bolezen Charcot – Marie – zob tipa 1A; dedna nevropatija, odgovorna za tlačne palzije, ki je posledica vzajemnega podvajanja ali brisanja 17p12; 17 Sindrom Smith – Magenis in sindrom Potocki – Lupski, ki je povezan z brisanjem ali podvajanjem 17p11.2. 18, 19, 20, 21 Miller-Diekerjev sindrom, za katerega je značilna lisencefalija in značilne obrazne poteze, je posledica subtelomerne delecije 17p, v katero je vključen PAFAH1B / LIS1 , 22 pa je poročalo, da heterorozno podvajanje PAFAH1B / LIS1 povzroči nevrorazvojne zamude. 7, 23

Nedavno so poročali o štirih duševno zaostalih bolnikih s kromosomskimi mikrodelevanci, ki so si v 17p13.1 delili prekrivajoči se odsek 180 kb. Čeprav so bili fenotipi bolnikov zaradi spremenljivih velikosti brisanja različni, so bile skupne značilnosti duševna zaostalost, mikrocefalija in nenormalni izvidi magnetne resonance (MRI) cerebralne bele snovi. 24 Identificirali smo novega pacienta z mikrodelezijo 17p13.1, ki ima skupne lastnosti. V regiji s prekrivanjem delecije so vključeni nekateri geni, ki kandidirajo za fenotip. Ker je o njihovem prispevku k fenotipu malo znanega, smo analizirali DLG4 / PSD95 in GABARAP z uporabo zarodkov zebre z ribami morpholino kot sistemski organizem. Opravili smo tudi kohortno študijo, v kateri smo iskali človeške mutacije v DLG4 / PSD95 in GABARAP .

Materiali in metode

Predmeti

V našem kohortnem študiju genomskih aberacij pri kopiranju številke je bil navedeni bolnik diagnosticiran s kromosomsko delecijo. Po pridobitvi informiranega soglasja družin pacientov na podlagi dovoljenja etičnega odbora zavoda je bilo od pacientov z idiopatsko duševno zaostalostjo in / ali epilepsijo, katerih etiologija ni bila znana, uporabljeni za preiskovanje genske kopije oz. številčne aberacije z uporabo aCGH. Nato so bili vzorci brez genskih aberacij med številom kopij uporabljeni za presejanje mutacij kandidatnih genov. Za drugi pregled je bilo uporabljenih 142 vzorcev bolnikov z nevrološkimi simptomi, vključno z razvojno zamudo z epilepsijo / brez nje. Genomsko DNK smo odvzeli iz periferne krvi s pomočjo kompleta za ekstrakcijo DNA QIAquick (Qiagen, Hilden, Nemčija).

aCGH analiza

analiza aCGH je bila izvedena s pomočjo čipa Human Gome CGH Microarray 244 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). S pomočjo programske opreme CGH Analytics različice 3.5 (Agilent Technologies) smo vizualizirali 25 genskih kopij.

Analiza fluorescence in situ hibridizacije

Metafazni ali prometni fazni kromosomi so bili pripravljeni iz fitohemaglutininskih stimuliranih limfocitov periferne krvi po standardni tehniki in uporabljeni za fluorescenco in situ hibridizacijo (FISH), kot je opisano drugje. 25 Petnajst klonov BAC, RP11-104O19, RP11-1038H1, RP11-198F11, RP11-305G1, RP11-46I8, RP11-457I18, RP11-104N2, RP11-61B20, CTD-2015K4, RP11-542C16, RP11-104H15, RP11 -1081A10, RP11-89D11, RP11-1099M24 in RP11-1D5, ki so vsi preslikani okoli 7p13.2p13.1, in RP11-153A23, ki so preslikani na 17q25.3 in uporabljeni kot marker, izbrani iz človeškega genoma UCSC brskalnik, marec 2006 (//genome.ucsc.edu/) (tabela 1).

Tabela polne velikosti

Analize mikrosatelitskih markerjev

Analize mikrosatelitskih markerjev so bile izvedene za določitev izvora brisanja s pomočjo šestih mikrosatelitskih markerjev, D17S1832, D17S938, D17S796, GATA158H04, D17S1881 in D17S578 (tabela 1), ki so bili izbrani s spletne strani raziskovalne fundacije Marshfield Clinic Research (// www. marshfieldclinic.org/chg/pages/default.aspx). Podatki o primerjih markerjev so bili pridobljeni v brskalniku UCSC Human genom, marec 2006 (//genome.ucsc.edu/). Amplifikacija polimerazne verižne reakcije (PCR) je bila izvedena po standardni metodi. Amplikone smo vizualizirali z obarvanjem z etidijevim bromidom po ločitvi z elektroforezo na 12% akrilamidnem gelu. 25

Vzdrževanje zebre

Odrasle zebrafice ( Danio rerio ) so bile vzdrževane pri 28, 5 ° C v pogojih 14-h svetlobe / 10-h temnega cikla. Gnojena jajca iz naravnih križancev so bila zbrana nekaj minut po drstenju in gojena pri 28, 5 ° C v vodi, ki je vsebovala 0, 006% NaCl, 0, 00025% metilen modre in 0, 003% N- feniltioureje. Zarodki so bili stagnirani glede na morfologijo in ure po oploditvi (hpf). 26

Analiza zaporedja dlg4 in gabarap pri zebri

5 ' neprevajano regijo (UTR) dlg4 v našem sevu zebrafisk smo klonirali po 5' RACE metodi s prajmerji (dopolnilna tabela 1), ki so bili oblikovani v skladu s poročevalnim zaporedjem dlg4 (NM_214728). Delni fragment zebrafish gabarap, ki vsebuje nepopolnih 5 ′ in 3 ′ UTR-jev, in celoten odprt bralni okvir je bil tudi okrepljen z reverznim prepisanim (RT) -PCR s temeljnimi premazi (dopolnilna tabela 1), ki je bil zasnovan v skladu s poročenim zebrafish gabarap (Pristop # BC065894). Ta PCR produkt smo klonirali v pGEM-T vektor (Promega, Madison, WI, ZDA), nastali plazmid pGEM- gabarap pa je služil kot predloga za sintezo RNA sonde. Skupaj RNA smo ekstrahirali iz 24 zarodkov hpf z uporabo kompleta RNeasy Mini (Qiagen). cDNA smo sintetizirali z uporabo Omniscript RT kompleta (Qiagen). Vse reakcije PCR smo izvedli s KOD plus DNK polimerazo (Toyobo, Osaka, Japonska). Za 5 'RACE je bil uporabljen 5-polni RACE Core Set (TAKARA, Otsu, Japonska).

Celotna hibridizacija in situ

Hibridizacija in situ in situ je bila izvedena, kot je opisano. 27 Protisenska RNA sonda za gabarap je bila sintetizirana z uporabo T7 RNA polimeraze (TAKARA, Otsu, Japonska), kot predlogo pa je bil uporabljen zgoraj opisan klon pGEM- gabarap .

Morfolinovi in ​​mikroinjekcije

Morpholino antisens oligos (MO) smo kupili pri GENE TOOLS (Philomath, OR, ZDA) (dodatna tabela 1). Skladiščenje in mikroinjekcija sta bila izvedena, kot je opisano. 27

Priprava odsekov glave zebrefis

Zarodke zebrice na ustreznih stopnjah smo fiksirali s 4% paraformaldehidom v PBS pri 4 ° C čez noč. Fiksni zarodki so postopoma dehidrirali z etanolom, namočenim v ksilen, prenesli v vgradni medij Paraplast Plus (McCormick Scientific, St Louis, MO, ZDA) in ga pod mikroskopskim opazovanjem vgradili v Paraplast Plus. Vzorci so bili razrezani na serijske odseke (7 μm) in obarvani z Mayerjevo raztopino hematoksilina in eozina.

Analiza zaporedja DLG4 / PSD95 in GABARAP

Vsi eksoni DLG4 / PSD95 in GABARAP pri navedenem bolniku in 142 bolnikov z nevrološkimi simptomi so amplificirali s PCR z uporabo prvotno zasnovanih prajmov, ki so nameščeni v obeh sosednjih introničnih zaporedjih (dodatna tabela 2) po standardni metodi. Vsi amplikoni so bili podvrženi direktnemu zaporedju z uporabo BigDye Terminator Cycle Sequisting Kit (Applied Biosystems, Foster city, CA, ZDA). Reakcije sekvenciranja smo analizirali z genetskim analizatorjem 3130 × l (Applied Biosystems).

REZULTATI

Molekularna citogenetska analiza

Pri bolniku z zaostankom v razvoju in epilepsijo smo ugotovili mikro-odmik 2, 3 Mb, ki sega od 17p13, 2 do p13, 1 (sliki 1a in b; tabela 1). Dvobarvna analiza FISH s kloni BAC je potrdila območje brisanja (slika 2a). V DNK njegovih staršev ni bilo črtanja, kar bi kazalo na novo izbris pri pacientu. Glede na človeško referenčno zaporedje iz marca 2006 (NCBI Build 36.1) je bil končni kariotip tega pacienta približno 17p13.2p13.1 (4 937 065–7 203 194) × 1.ich (RP11–104O19 +, RP11–1038H1 +, RP11 –198F11 +, RP11–305G1 +, RP11–46I8 +, RP11–457I18−, RP11–104N2−, RP11–61B20−, CTD – 2015K4−, RP11–542C16−, RP11–104H15 +, RP11–1081A10 +, RP11–89D11 +, RP11– 1099M24 +, RP11–1D5 +, RP11–153A23 +) dn (tabela 1). Med šestimi uporabljenimi mikrosatelitskimi markerji je bil le D17S1881 informativen in je pokazal, da ima ta pacient skupne pasove samo z materjo (slika 2b; tabela 1). Tako smo sklepali, da je pri pacientu izbrisan očetovski alel na tem lokusu.

Image

Fizikalna karta kratkega kraka kromosoma 17 in delecij, opaženih pri bolnikih. ( a, b ) aCGH profili kromosoma 17, kot kaže analiza CGH v kromosomskem pogledu ( a ) in genskem pogledu ( b ). Navpična os označuje razmerje log 2 genske številke kopije. Modri ​​pravokotnik označuje območje odstopanja od števila kopij z velikostjo 2, 3 Mb. V genskem pogledu ( b ) se območje aberacije razširi. Pike označujejo lokacije in ustrezna razmerja log 2 sond. Črni pravokotniki na genskem pogledu kažejo lokacije znanih genov v tej regiji (prikazani v poševnem tisku). Kandidatni geni, DLG4 / PSD95 , GPS2 , GABARAP in KCTD11 , so poudarjeni z rdečo. Odprti pravokotniki označujejo mesta podvojenih podvajanj in odstopanja od števila kopij. Spodaj je prikazan SRO. 24 ( c ) Območja črtanja so prikazana z modrimi črtami. Celotna barvna različica te številke je na voljo v spletni reviji Journal of Human Genetics .

Slika v polni velikosti

Image

Molekularne citogenetične analize. ( a ) Dvobarvna analiza RIB z uporabo kombinacije BAC klona CTD-2015K4 (rdeča) kot cilja in RP11-153A23 (zelena) kot markerjev kromosoma 17. Obstaja samo en rdeč signal, ki kaže na črtanje tega območja v enem alelu. ( b ) Analize mikrosatelitskih markerjev z uporabo D17S1881. PCR produkte D17S1881 ločimo na akrilamidnem gelu in vizualiziramo z etidijevim bromidom. m, označevalec molekularne velikosti; Fa, oče; Pa, potrpežljiv; Mo, mati. Pasovi sedanjega pacienta so običajni samo z materino. To kaže, da je delecija izvedena iz očetovskega kromosoma. Celotna barvna različica te številke je na voljo v spletni reviji Journal of Human Genetics .

Slika v polni velikosti

Poročilo o bolniku

5-letni deček se je rodil spontano v gestacijski starosti 39 tednov in 1 dan po nezahtevni nosečnosti. Njegov oče je bil ob rojstvu star 33 let, mama pa 31 let. Oba starša sta bila zdrava in nezahtevna. Devetmesečna mlajša sestra je bila zdrava. Teža rojstva probande je bila 2480 g (<10. pertiletil), njegova rojstna dolžina je bila 49, 0 cm (50. pertiletil), obseg glave pa 33 cm (50. pertiletil). Amnijska tekočina je bila onesnažena z mekonijem, aspiriranje amniotske tekočine pa je bilo izvedeno s inkubacijo sapnika. Zaradi asfiksičnega dihanja so ga sprejeli na neonatalno intenzivno nego. Elektrokardiografija in ultrazvočni pregled ni pokazal nenormalnosti srca ali trebušnih organov, razen rahlo razširjene uteropelvične regije. Merjenje odziva slušnega možganskega debla ni pokazalo nepravilnosti.

Njegov kriptorhizem so kirurško popravili v starosti 16 mesecev. Pokazal je bruto zamudo motorja, vzpostavljal je nadzor glave pri 5 mesecih, prevrnil se je pri 8 mesecih, sedel sam pri 11 mesecih, sam hodil pri 2 letih in svojo prvo besedo govoril pri 14 mesecih. Elektroencefalografija je bila zaradi zamude v razvoju opravljena pri 17 mesecih, očitno pa nenormalnosti niso opazili.

Pri starosti 2 let se je razvil napadi kataplektike, ki so včasih povzročili nezavest. Valprojsko kislino je prejel pri starosti 2 let in 5 mesecev, vendar njegovi napadi s tem zdravljenjem niso bili nadzorovani. Elektroencefalografija je razkrila hipsaritmijo z difuznimi polispiki in razpoki valov (dodatna slika 1). V bolnišnico so ga sprejeli na zdravljenje z adrenokortikotropnimi hormoni, da bi nadzoroval svoje epileptične napade pri starosti 2 let in 11 mesecev. 28 V tem času je bila njegova višina 87, 8 cm (10. pertiletil), njegova teža je bila 11 kg (3. pertiletil), obseg glave pa 48, 1 cm (<25. Percentil). Opažene so bile dismorfne značilnosti, vključno s širokim nosnim korenom, visoko obokanimi nepci, nizko nastavljenimi ušesi, hrapavimi lasmi, telekantusom, mikroretrognatijo (slika 3) in ravnimi stopali. Količnik njegovega razvoja je bil 46 v skladu z Enjoji lestvico psihološkega razvoja. 29 Število krvnih celic, glukoza, analiza urina, raziskave aminokislin, študije delovanja jeter in ščitnice ter cerebrospinalna tekočina so bili normalni. Po adrenokortikotropnem hormonskem zdravljenju se je pojavnost epileptičnih napadov zmanjšala. Analiza kromosomov z G-obrobo je pokazala moški kariotip 46, XY. Za preučevanje etiologije razvoja tega bolnika so za to študijo zagotovili bolnikov vzorec krvi. MRI možganov pri njegovih 5 letih je pokazal blago zmanjšanje volumna bele snovi (dodatna slika 2).

Image

Bolnik v starosti 2 let in 11 mesecev. Prikazane so dismorfne lastnosti, vključno s širokim nosnim korenom, visoko obokanimi nepci, nizko postavljenimi ušesi, hrapavimi lasmi in telekantusom.

Slika v polni velikosti

Vbrizgavanje dlg4 –MO ne kaže izrazitih napak v razvoju možganov

V izbrisanem območju kromosoma 17p13.1 tega pacienta sta za nastanek zamud pri razvoju tega bolnika morda odgovorna dva gena, DLG4 / PSD954 30 in GABARAP 31, ker so prejšnje študije pokazale vpletenost teh dveh genov v nevrološke funkcije.

Zebrafish dlg4 se izrazi v možganih v razvoju in odraslih na način, ki je podoben izrazu njegovega homologa tako pri ljudeh kot pri miših, 32, 33, 34, kar kaže na to, da se zebra lahko uporablja kot vzorčna žival za pregled tega gena. Zato smo se najprej osredotočili na funkcijo dlg4 med možganskim razvojem pri zebri . Čeprav so poročali o homologu zelišč za dlg4 (NM_214728), so bile za funkcionalno analizo z uničevanjem genov z uporabo MO-jev potrebne informacije o zaporedju 5 'UTR v našem sevu zečje ribice. Tako smo opravili 5 ′ RACE in dobili 12-nukleotidni fragment, ki ustreza zgornjem toku območja iniciacijskega prevoda, za katerega je bilo ugotovljeno, da je identično s poročevalnim zaporedjem (podatki niso prikazani). Nato smo ugotovili, ali je izbris lokusa DLG4 / PSD954 privedel do okvare rasti možganov, izvedli genski knockdown dlg4 pri zebri . Vendar pa je mikroinjekcija morfolinove vrste, ki blokira prevod, proti dlg4 ( dlg4 -MO) povzročila različne vrste napak, ki so se od posameznika do posameznika razlikovale brez očitne težnje (dodatna slika 3). Ker nismo mogli potrditi možne povezave med fenotipom našega pacienta in izbrisom lokusa DLG4 / PSD954 , smo opustili nadaljnjo preiskavo udeležbe dlg4 pri razvoju možganov zebrefis .

gabarap sodeluje pri možganskem razvoju

Z zebrafishom smo nato raziskali, ali ima gabarap , še en gen, ki bi bil lahko odgovoren za simptome tega pacienta, kakršne koli funkcije pri razvoju možganov, ker bi to lahko bilo odgovorno za simptome sindroma mikrodelekcije 17p13.1. Najprej je bil določen vzorec genske ekspresije gabarap med razvojem pri zebri . Pri 24 KMf se je izrazil gabarap v glavi, zlasti v telencefalonu, zadnjem možganu in rombomeru (slika 4a). Kasneje v razvoju, pri 72 KMf, je bilo opaziti izražanje v ventralnem centralnem živčnem sistemu skozi sprednji možgan do zadnjičnega mozga (slika 4b). Ker so ti izraženi vzorci gabarapa v razvijajoči se glavi kazali na možne funkcije tega gena pri razvoju možganov, smo izvedli genski knockdown gabarap . Ko so v vsak zarodek vbrizgali 3 ng gabarap -MO1, prevodu, ki blokira prevod, je večina morfatov (88%, n = 150) pokazala rahlo pritlikavnost celega telesa z močno hipoplastično glavo in čeljustjo (sliki 4g in h). Čeprav je lahko vključena splošna zaostalost rasti, je možno tudi, da te vidne hipoplastične glave in čeljust kažejo na mikrocefalijo in mikroretrognatijo, ki sta jih opazili pri predhodno poročanih bolnikih s sindromom mikrodelekcije 17p13.1. 24 Da bi potrdili, ali je ta napaka specifično vplivala na gensko porušenje gabarap-a, smo uporabili gabarap -MO2, drugo MO, ki blokira prevod z različnim zaporedjem. Ko smo vbrizgali 3 ng gabarap -MO2, je približno dve tretjini morfatov (63%, n = 90) gabarap -MO2 pokazalo podoben fenotip kot gabarap -MO1 (sliki 4i in j). Tega fenotipa skoraj nismo opazili pri zarodkih (1, 3%, n = 300) ali pri zarodku (6, 7%, n = 90), ki ga je injiciral MO (sliki 4c – f). Ti rezultati kažejo, da sta hipoplastični vzorec glave in mandibule povzročili gensko propadanje gabarapa in da je gabarap potreben za normalen razvoj sprednjih struktur. Čeprav smo poskusili z reševalnim poskusom mRNA z mRNA GABARAP , nismo mogli dobiti prepričljivih doslednih rezultatov (podatki niso prikazani).

Image

Funkcionalne analize gabarap z uporabo zebre . Prostorska izraženost gabarap v zarodkih divjega tipa pri 24 hpf ( a ) in 72 hpf ( b ). Ti vzorci so bili fiksirani s 4% paraformaldehidom, dehidrirani in rehidrirani postopoma. V skladu s temi koraki se oblike fiksnih vzorcev razlikujejo od oblik živih zarodkov (primerjamo s c - j ). Puščica in oklepaj ( a ) pomenita izražanje gabarapa v telencefalonu in v zadnjem možganu do rombomerja. Gensko popuščanje gabarapa smo analizirali z zebrafish pri 72 hpf ( c - n ). Hipoplastična glava in čeljust (puščice) sta prikazani pri gabarap morfih ( g - j ). Prečni preseki, ki vsebujejo sprednjo možgino zebre pri 72 KMf ( k - n ). V gabarap- morfatih ( m, n ) smo opazili dilatacije prekata. Dorsal je do vrha. ( a - k ) Rostral je levo.

Slika v polni velikosti

Za preučitev, ali gabarap -MO morfanti kažejo histološke nepravilnosti možganov, so pripravili prereze glave. Na podlagi izraza vzorca gabarap smo se osredotočili na odseke, ki vključujejo sprednji možgan . Pri normalnem možganskem razvoju zebre se možganski prekat zoži, ko razvoj napreduje in se skoraj napolni pri 72 hpf (sliki 4k in l). V primerjavi s tem se je prekat v obeh gabarap mornikih očitno zadrževal na odsekih z enakih relativnih položajev tako divjih kot kontrolnih morfanov (sliki 4m in n). Na splošno ti rezultati močno kažejo, da ima gabarap pomembne funkcije pri normalnem razvoju možganov pri zebri.

Pregled mutacij za DLG4 / PSD95 in GABARAP

Pri preostalem alelu navedenega bolnika in drugih 142 bolnikih z nevrorazvojnimi motnjami niso ugotovili mutacij, ki povzročajo bolezni pri DLG4 / PSD95 in GABARAP .

DISKUSIJA

Pri našem bolniku je bila ugotovljena mikrodelekcija 17p13.2p13.1, ki je pokazala značilne dismorfne lastnosti, razvojno zakasnitev in nedopustno epilepsijo. Ta izbris se je prekrival s predhodno prijavljenimi mikrodelekcijami 17p13.1 (slika 1). 24 Poročani štirje bolniki so pokazali običajne klinične manifestacije, vključno z duševno zaostalostjo, mikrocefalijo, nenormalnimi izvidi MRI možganov z zapoznjeno mielinizacijo in nekaterimi dismorfnimi izvidi, vključno z epikantičnimi gubami, nizkim nosnim mostom in mikroretrognatijo, kljub spremenljivosti velikosti brisanja. Ker je bila končna točka prekinitve izbrisa pri našem bolniku na najbolj telomernem območju v primerjavi s predhodno poročanimi izbrisi, je to zožilo najkrajšo prekrivno regijo (SRO) na chr17 (7 054 400–7 203 194), s 178, 3 na 148, 8 kb (tabela 2; slika 1). 24 Prekrivajoča se klinična manifestacija med našim bolnikom in predhodno poročanimi bolniki je duševna zaostalost, nepravilnosti MRI in izrazite obrazne poteze, vključno z epikantičnimi gubami, nizkim nosnim mostom in mikroretrognatijo (dodatna tabela 3). Tako bi bili odgovorni geni za te manifestacije vključeni v zoženi SRO. V primerjavi s kliničnimi fenotipi štirih bolnikov je 24 bolnikov edinstven z vlečno epilepsijo, vendar brez mikrocefalije.

Tabela polne velikosti

Kartiranje genomske preureditve pri bolnikih z več prirojenimi anomalijami je povečalo naše razumevanje etiologije bolezni in vodilo do identifikacije številnih genov, ki povzročajo bolezen, vključno s CHD7 35 in STXBP1 . 36 Zožena SRO 17p13.1 je majhna z velikostjo 148, 8 kb, vendar je bogata z geni in vključuje 17 genov (znani geni, ki kodirajo beljakovine, vzeti iz referenčnih sekvenc mRNA, UCSC Human Genome Browser, marec 2006; Slika 1b, Dodatna tabela 4). Geni v tej SRO so bili analizirani in odvzeti štiri gene, DLG4 / PSD95 , GPS2 , GABARAP in KCTD11 kot kandidate za povzročitev duševne zaostalosti. 24 DLG4 / PSD95 kodira člana družine membransko povezane gvanilat kinaze, ki je močno izražen v ekscitacijskih glutamatergičnih sinapsih v možganih. 37 DLG4 / PSD95 je pomemben za spajanje receptorja N -metil-D-aspartata na poti, ki nadzorujejo dvosmerno sinaptično plastičnost in učenje. 38 Vendar je več raziskav poročalo, da knockout miši DLG4 / PSD95 ne kažejo bistvene funkcije v sinaptičnem razvoju DLG4 / PSD95 . 39 Prav tako tudi naša knobdown zebra ni pokazala morfoloških nepravilnosti. Kljub temu ne moremo izključiti možne funkcije tega proteina v nevrorazvoju brez nadaljnjega preučevanja. KCTD11 je zaviralec signala Sonic Jež, za katerega je znano, da se v medulloblastoma deregulira. 40 Signalizacijo ježev je bilo opisano kot kritično pri morfogenezi možganov z uravnavanjem ventralnega vzorčenja nevralne cevi. 41 GPS2 v interakciji z regulacijskim faktorjem X4, varianta 3 (RFX4_v3), da modulira transaktivacijo genov, vključenih v možgansko morfogenezo in mutagenezo pri miših, kaže, da je Rfx4_v3 ključnega pomena za normalen možganski razvoj. 42 Iz teh razlogov lahko haploinsuficičnost teh genov prispeva tudi k fenotipu tega pacienta.

Glede kandidatnih genov za zamudo v razvoju možganov smo bili pozorni na GABARAP v regiji za brisanje. GABA (A) receptorji so kloridni kanali z ligandnimi zaporami, ki posredujejo zaviralno nevrotransmisijo. S presejanjem knjižnice cDNA z uporabo GABA (A) receptorja γ-2S podenote kot vabe je bil GABARAP identificiran kot potencialni veznik med GABA (A) receptorji in mikrotubuli. 31, 43 Trenutno se za GABARAP pojavlja splošnejša funkcija, vključno s prevozom receptorjev GABA (A) na in s celice, organizacijo GABA (A) receptorjev v post-sinaptične grozde in regulacijo gostote receptorjev v stanju dinamičnega ravnovesja . 43 Analizirali smo vzorce izražanja genov, vključenih v SRO, s pomočjo knjižnice silico (brskalnik GCSC gena), GABARAP pa je pokazal višjo stopnjo ekspresije v možganih. Ker je o funkcijah GABARAP malo znanega, smo na to pozoreli kot na potencialni gen za razvoj nevronov. Za potrditev prispevka le-tega k fenotipu pacienta smo uporabili tehniko genskega popuščanja pri zebri. Ker so rezultati pokazali hipoplastične možgane in čeljust pri žebarjih z gabarapom, ki so v korelaciji s skupnimi fenotipi pacienta z delecijo 17p13.1, bo človeški GABARAP verjetno prispeval k razvoju sprednje strukture. Med bolniki z delecijo 17p13.1 je le naš bolnik pokazal nedopustno epilepsijo. Ker lahko pride do nemaskirane mutacije GABARAP-a , smo analizirali zaporedje GABARAP-a v preostalem alelu našega pacienta, vendar patogenih mutacij ni bilo. Razlog za fenotipsko razliko med bolniki z delecijo 17p13.1 ni znan. Analizirali smo 142 vzorcev DNK pri bolnikih z duševno zaostalostjo z / brez epilepsije in pri bolnikih z nevrorazvojnimi motnjami ni bilo patogenih sprememb nukleotidov. Še vedno pa je mogoče, da so nukleotidne mutacije v DLG4 / PSD95 in GABARAP patogeni vzrok za nevrorazvojne zamude in epilepsijo.

Ker obstajajo drugi močni geni kandidati, vključno z GPS2 in KCTD11 , za nevrorazvojno zakasnitev in epilepsijo v tej regiji, bodo potrebne nadaljnje študije za gene v tej regiji.

Dodatne informacije

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dodatne informacije spremljajo prispevek na spletni strani Journal of Human Genetics (//www.nature.com/jhg)