Domena samoobdelave z dvojno celoto, ki usmerja sinhronizirano ekspresijo beljakovin tako v prokariotih kot v evkariotih | znanstvena poročila

Domena samoobdelave z dvojno celoto, ki usmerja sinhronizirano ekspresijo beljakovin tako v prokariotih kot v evkariotih | znanstvena poročila

Anonim

Predmeti

  • Ekspresijski sistemi
  • Molekularni inženiring

Izvleček

Sposobnost usklajevanja soekspresije več beljakovin je potrebna za številne pomembne aplikacije, kot so sestavljanje beljakovinskih kompleksov, zlaganje lastnosti in metabolični inženiring. Trenutno je na voljo le nekaj možnosti za več kokompresijo rekombinantnih beljakovin, večina pa ni uporabna tako za prokariontske kot evkariontske gostitelje. Tu poročamo o novem poliproteinskem vektorskem sistemu, ki temelji na paru samozbudnih mini-intein, zlitih v tandemu, imenovanih domena dvojnega inteina (DI), da bi dosegli sinhronizirano koekspresijo več proteinov. Področje DI obsega Ssp DnaE mini-intein N159A mutant in Ssp DnaB mini-intein C1A mutant, povezan v tandemu s peptidnim veznikom, da posreduje učinkovito sproščanje stranskih beljakovin z avtokatalitičnim cepitvijo. Dokazano je bilo popolno sproščanje sestavnih beljakovin, GFP in RFP (mCherry), iz predhodnika poliproteina v bakterij, sesalcev in rastlinskih gostiteljev. Poleg tega uspešna so-ekspresija GFP s kloramfenikol acetiltransferazom in tioredoksinom z RFP še dodatno potrjuje splošno uporabnost DI poliproteinskega sistema. Naši rezultati skupno prikazujejo tehnologijo poliproteinov, ki temelji na DI, kot zelo dragocen dodatek k molekularnemu orodju za multi-proteinsko koekspresijo, ki najde široko uporabo v biotehnologiji, bioznanosti in biomedicini.

Uvod

Intein je naravno najden beljakovinski element, ki se sam izloči iz predhodnika beljakovin s sočasnim spajanjem (zlepljenjem) zaporednih beljakovinskih sekvenc, imenovanih ekstenzi. Ta postopek spajanja beljakovin je avtokatalizen in ne zahteva prisotnosti nobenih eksogenih gostiteljsko specifičnih proteaz ali kofaktorjev. Odkritje inteina je omogočilo široko paleto inovativnih aplikacij, vključno z encimsko aktivacijo, čiščenjem beljakovin, izraženo ligacijo proteinov in proizvodnjo cikličnih beljakovin 1, 2, 3, 4 . Poleg tega, da je učinkovit element za spajanje, je mogoče celote konstruirati tako, da blokirajo aktivnost spajanja in pospešijo samodejno ekscizijo na njihovem N- ali C- terminalu z mutiranjem ključnih ostankov terminala, pa tudi ostankov ekstenzij, ki se takoj prilegajo v celotno zaporedje . Tu izkoriščamo hiperaktivno samo-cepitev, ki je inteinitirana, za razvoj sistema za koordinacijo so-ekspresije več beljakovin iz enega odprtega bralnega okvira (ORF).

Hkrati in uravnoteženo soizražanje več beljakovin omogoča številne pomembne aplikacije v biokemiji, znanosti o življenju in biotehnologiji. Nekaj ​​pomembnih primerov je: ( i ) proizvodnja multimernih farmacevtskih proteinov, kot so protitelesa in cepiva z več podenotami za diagnozo in zdravljenje bolezni 5, 6, 7 ( ii ) sinteza beljakovinskih kompleksov za biokemične, biofizikalne in strukturne študije 8 ; ( iii ) sprememba presnovnih poti 9 ; ( iv ) razjasnitev organiziranosti in urejanja zapletenih presnovnih mrež 10 ; kot tudi ( v ) inženiring poljščin z zaželenimi agronomskimi lastnostmi 11 .

Trenutno se najpogosteje izvajajo tri strategije za so-ekspresijo več beljakovin: ( i ) več monocistronskih ekspresijskih kaset na istih ali ločenih vektorjih; ( ii ) polikistronski vektorji, ki temeljijo na mestu vezave ribosoma (RBS) ali na notranjem ribosomalnem mestu (IRES) za prokariontske in evkariontske gostitelje; in ( iii ) poliproteinske prenašalce, ki temeljijo na 2A-podobnem peptidnem ali proteaznem substratnem virusu slinavke in parkljevke (parkljevke in parkljevke), ki so podobni peptidu ali proteaznemu substranu 12, 13 . Glede uporabe več monocistronskih kaset za koekspresijo, nadzora nad stehiometrično ekspresijo več transgenov ni mogoče zlahka doseči niti po obsežni promocijski ureditvi. Tudi vodenje ekspresije vsake transgene kasete z uporabo iste vrste promotorja ne pomeni nujno iste stopnje izražanja za vsak transgen 14 . Kadar se povezane eksgene eksgene kasete uporabljajo na enem vektorju, ker vsaka genska kaseta vsebuje svoj nabor regulacijskih elementov, bi lahko velikost vektorja postala precej velika, zlasti če se število transgena poveča. Tako velika velikost vektorja lahko bistveno zmanjša učinkovitost transformacije / transfekcije. Kar se tiče prevajalne iniciacije, posredovane z IRES, je znano, da je v primerjavi s tisto iniciacijo, posredovano s petimi kapicami, veliko manj učinkovito. To vodi do zelo neenakomernega soizražanja, učinkovitost pa se kaže kot v celičnem tipu 14 . Kar zadeva FMDV-2A ali 2A podobnim virusnim peptidnim sekvencam, na učinkovitost so-ekspresije proteina vpliva peptidna sekvenca ali beljakovinska struktura takoj pred motivom 2A na način, ki je slabo razumljiv 15, 16, 17 . Medtem ko so poročali o številnih primerih uspešnega soapresije, posredovanega z 2A, obstajajo tudi primeri, ko se velik del poliproteina ne loči na sestavne proteine 15 . Po sočasnem sproščanju lahko zaporedje 2A, ki ostane na karboksilnem koncu njegovega proteina, povzroči napačno ciljno delovanje celic ali pa moti zgibanje in delovanje nekaterih ciljnih beljakovin 12, 18 . Zlasti zlasti sistem, ki temelji na 2A- in IRES, deluje le v evkariontih.

Zaradi enostavnosti genske manipulacije in sposobnosti proizvajanja velike količine rekombinantnih beljakovin se Escherichia coli običajno uporablja kot testno ležišče za funkcionalne študije novih inženirskih beljakovin ali beljakovinskih kompleksov. Končna potrditev biološke funkcije proteina, ki nas zanima, pri drugem gostitelju, kot so celice rastlin ali sesalcev, bi bila potrebna, če je glavni cilj uporaba ali preskus delovanja beljakovin pri teh gostiteljih. Zato je treba vzpostaviti učinkovito platformo za ekspresijo z več proteini, ki jo je mogoče zlahka sprejeti pri različnih gostiteljih.

Tu poročamo o novem poliproteinskem vektorskem sistemu, ki temelji na paru samozbudnih mini-intein, zlitih v tandemu, imenovanih domena dvojnega inteina (DI), da bi dosegli usklajeno so-ekspresijo več beljakovin. Fuzijska domena DI obsega Ssp DnaE mini-intein N159A mutant in Ssp DnaB mini-intein C1A mutant, povezan v tandemu s peptidnim veznikom. Ta edinstvena fuzijska domena izkorišča sinergijo med aktivnostjo samodejnega odstranjevanja N- in C- terminala DnaE (N159A) in DnaB (C1A) mini-intein variante, da posreduje avtokatalitično sproščanje bočnih beljakovin in vivo (slika 1a ). Ker lahko celotna avtoprocesija učinkovito poteka tako pri prokariotih kot pri evkariotih, smo predvideli, da je sistem poliproteinov na osnovi DI lahko uporaben za različne ekspresne gostitelje. V tej raziskavi smo raziskali sistem DI pri gostiteljih bakterij, sesalcev in rastlin ter potrdili njegovo uporabnost v vseh testiranih sistemih gostiteljih.

Image

(a) organizacija poliproteinskega ORF na osnovi DI in avtoprocesiranje predhodnika poliproteina v dva ločena proteina (POI); ilustrirano za soizražanje GFP in RFP kot POI1 oziroma POI2. (b) Predlagani mehanizem avtocesenja, posredovanega z DI, predhodnika poliproteina POI1-DI-POI2. Puščice predstavljajo splošno cepitev celine (poti A in B).

Slika v polni velikosti

Rezultati in razprava

Zasnova poliproteinskega sistema na osnovi dvojnega inteina za učinkovito samodejno obdelavo

Učinkovita avtoprocesiranje (cepitev) predhodnika poliproteina in vivo v fizično ločene sestavne proteine ​​je bistvenega pomena pri razvoju vektorskega sistema, ki temelji na poliproteinu, za koordinacijo so-ekspresije več beljakovin iz enega ORF. To dosežemo tako, da vključimo vgrajene celostne elemente. Na splošno se celotno spajanje začne z reakcijo premika acila NS / O na amidni vezi pred N-terminalnim stičiščem s stransko verigo prvega celotnega ostanka (položaj 1, običajno Cys ali Ser) (dopolnilna slika S1). Potem se dobljeni linearni (tio) ester intermediat podvrže trans (tio) esterifikaciji z nukleofilnim napadom iz sulfhidrilne ali hidroksilne skupine na stranski verigi prvega ostanka C-ekstenzija (položaj +1, običajno Cys, Ser ali Thr) in naknadno tvori razvejen intermediat. Na koncu se razvejan intermediat razreši s Asnovo ciklizacijo celotnega C-terminala, da se sprosti fragment celine in se liga N- in C-raztezki prek (tio) ester vezi, ki jo je mogoče spontano preurediti v bolj stabilno amidno vez 19 .

Razvoj sistema DI je utemeljen s tem, da je mogoče reakcije samodejnega odstranjevanja N- in C-terminalov, ki jih povzročajo inženirji, izolirati in uglasiti ločeno 19 . Tu je vsaka celotna domena v kaseti DI neodvisno optimizirana, da se maksimira aktivnost samodejnega odstranjevanja N-terminala in C-terminala Ssp DnaE in DnaB intein. Kot je prikazano na sliki 1b, smo za mini-celoten del Ssp DnaE sistema DI ( 1 ) ustvarili mutacijo Ala na položaju 159 (N159A), da bi ukinili ciklizacijo Asna, in vključili ostanek Asp na položaju -1 (Asp -1) za katero je bilo sporočeno, da pospešuje samodejno cepljenje Ssp DnaE na njegovem spojnem spoju N-terminala 20 . Z mutacijo N159A naj bi sproščanje N-ekstenzija potekalo s hidrolizo labilne tioesterske vezi v linearnem ( 2 ) in razvejanem ( 3 ) intermediatuh po splošnem avto-cepljenju med celicami N-terminala (Slika 1b, Pathways A & B) 19 . Za mini-celoten del Ssp DnaB v 1 smo vgradili mutacijo Ala na položaju 1 (C1A), ki blokira nastanek tioesterskih vezi pred N-koncem celotne. Poleg tega so bili ostanki Ser-Arg, za katere je bilo eksperimentalno potrjeno, da dajejo visoko aktivnost C-terminalnega samodejnega čiščenja, vključeni po stičišču C-terminala na položaju +1 in +2 celotnega dela DnaB 21 . Na podlagi izdelanega DI sistema smo sestavili panel reporterskih poliproteinskih konstrukcij, s katerimi sistematično preučujemo ključne dejavnike, ki vplivajo na avtoprocesno aktivnost domene DI. Vsaka od teh konstrukcij kodira poliprotein (slika 1a), v katerem je zaporedje DI zasipano med zgornjo različico GFP (GFP 172 ; POI1) 22 in nizvodno mCherry sekvenco, ki nosi oznako strep C-terminala (RFP Strep ; POI2) . T7 promotor, humani citomegalovirus (CMV) promotor in (oc) 3 / mas promotor smo uporabili za spodbujanje ekspresije poliproteinov na osnovi DI v E. coli , sesalskih HEK293T celicah in Nicotiana tabacum .

Celična predelava dvojnega intein poliproteina v bakterijskih, sesalskih in rastlinskih ekspresijskih sistemih

Za raziskovanje obsega avtoprocesiranja poliproteinov, posredovanih z DI, so bili proteinski izvlečki iz E. coli , HEK293T in tobačnih NT1 celic, ki izražajo konstruktor reporterja GFP 172 -DI-RFP, izpostavljeni analizi anti-GFP in anti-Strep tag Western blots . Kot je prikazano na sliki 2, sta bila GFP 172 in RFP Strep skoraj v celoti sproščena iz predhodnika poliproteina v vseh testiranih gostiteljskih sistemih. Spodnji imuno reaktivni pas, ki se je pojavil v zaščitnem blotu proti Strepu, predstavlja delno hidroliziran produkt mCherry, ki je rezultat priprave vzorca za gel elektroforezo 23 . Predelavo sistema poliproteina DI na celotni ravni rastlin smo raziskovali v transgeni N. tabacum cv. Xanthi rastline, ki izražajo poročevalski konstrukt GFP 172 -DI-RFP Strep . Tako kot pri nediferenciranih tobačnih celicah NT1 smo tudi na osnovi analize droga, stebel in korenin na podlagi analize Western blot-a (slika 3a) opazili učinkovito cepitev na N- in C-termininih DI-fuzijske domene. Medtem ko ni bilo opaziti bistvene razlike v obsegu cepitve med različnimi rastlinskimi tkivi, je bila najvišja stopnja izražanja v koreninskem tkivu. To je predvsem posledica uporabljenega promotorja (oc) 3 / mas, ki daje največji izražanje korenin, kot poročajo tako v rastlinah tobaka kot koruze 24, 25 . Poleg N. tabacuma smo učinkovito obdelavo DI poliproteina opazili tudi v listnih tkivih Nicotiana benthamiana in Lactuca sativa L. var. longifolia (romska zelena solata) s prehodnim izražanjem z agroinfiltracijo (sliki 3b in 3c). Dokazovanje učinkovitosti sistema DI v N. benthamiani je še posebej zanimivo, saj agroinfiltracija te rastlinske vrste ponuja zelo obetavno obsežno rekombinantno platformo za proizvodnjo protiteles, ki je bila uporabljena za izdelavo ZMapp, obetavnega zdravila za boj proti izbruhu ebole 26, 27 .

Image

(a) Sprostitev beljakovin pred preskusom z uporabo protitelesa proti GFP. (b) Sproščanje proteina v nadaljnjem toku je bilo potrjeno z uporabo protitelesa proti strepu. V nadaljevanju "M" predstavlja beljakovinske markerje, "WT" pomeni ne-transformiran nadzor divjega tipa in "*" pomeni degradiran fragment RFP Strep, ki je posledica priprave vzorca za gel elektroforezo (podrobnosti glej v besedilu).

Slika v polni velikosti

Image

(a) Listnato, steblo in koreninsko tkivo stabilno preoblikovanih rastlin N. tabacum . (b) Listna tkiva agroinfiltrirane N. benthamiana. (c) Listna tkiva agroinfiltrirane L. sativa L. var. longifolia .

Slika v polni velikosti

Določitev mest cepitve v dvojnem celoten predhodnik poliproteina

Za nadaljnjo preučitev, ali je bilo opaženo celično cepitev predhodnika poliproteina posebej pripisano avtokatalitični cepitveni dejavnosti cepitvene domene DI, so bili neaktivni celinski mutanti z blokiranim N-ali C-terminalnim samodejnim cepljenjem uporabljeni za nadomestitev cepilno aktivnih celih v domeni DI. Natančneje, prvi (Cys, položaj 1 celoten DnaE) ali zadnji (Asn, položaj 154 DnaB intein) v DI domeni je bil mutiran na Ala, da bi ustvaril N-neaktivno ali C-neaktivno DI, torej. Kot je prikazano na sliki 4a, ko je bil uporabljen DI cepitve, ki ni aktiven na N-terminalu, gorvodni GFP 172 se ni mogel ločiti od domene DI, vendar ker je cepitev C-terminala še vedno aktivna, bi še naprej lahko bil RFP Strep sproščen iz predhodnika poliproteina. Podobno je bilo pri cepljenju, ki ne deluje na C-terminalu, gorvodni GFP 172 je bil sproščen iz domene DI, vendar nižje RFP Strep ni nižje (slika 4b). Ta rezultat je potrdil, da je bilo zelo učinkovito poliproteinsko avtomatsko cepitev, opaženo z aktivno domeno DI, resnično posledica specifičnega delovanja domene DI, kot je opisano v mehanizmu cepljenja celih celic (slika 1b).

Image

(a, b) Analiza Western blot vzorcev cepitve poliproteinov, ki imajo aktivne v primerjavi z N- ali C- neaktivnimi DI različicami, je potrdila sproščanje sestavnih proteinov (GFP 172 in RFP Strep ), pripisana avtokatalitičnemu cepitveni aktivnosti domene DI. Aktivnost cepitve N- ali C-konca domene DI je bila blokirana z mutacijo Ala na ustreznem cepilnem stičišču, da bi ustvarili N- in C-neaktivni mutant DI. (c) organizacija predhodnika poliproteina, ki prikazuje glavne domene proteinov (v škatli) in povezovalno zaporedje (modre barve); N-terminalno zaporedje aminokislin in analiza ESI-TOFMS sproščenih beljakovin sta razkrila cepitev poliproteina na pričakovanih mestih, ki jih kažejo puščice.

Slika v polni velikosti

Točna mesta cepitve znotraj poliproteina GFP 172 -DI-RFP Strep smo določili z analizo sproščenega RFP Strep in GFP 172, očiščenega iz transgenih tobačnih celic NT1. Glede na zaporedje N-terminalov, RFP izdelek, sproščen iz poliproteina, vsebuje N-terminalni Ser na položaju +1 celote DnaB (sledi zaporedje Arg-Gly-Pro), medtem ko je N-konec sproščenega GFP 172 bil ugotovljeno, da je blokiran. Kot je prikazano na sliki 4c, zaporedje Ser-Arg-Gly-Pro flankira C-terminalni spojni spoj DnaB celine in je torej potrdil, da je sprostitev nizvodnega RFP posredovana s samodejnim odstranjevanjem C-terminala celote. Nadalje je opazovana molekulska masa sproščenega izdelka GFP 172, izmerjena z uporabo ESI-TOFMS, 28.590, 90 Da, kar ustreza masi N-končnega acetiliranega GFP 172 (izračunana masa 28.593, 08 Da). Kot najpogostejši substrat za N-končno acetiltransferazo je bil Ser na N-koncu zgornjega toka GFP 172 verjetno acetiliran, ko je bil iniciator Met odstranjen metionin aminopeptidaza. Skupaj so te ugotovitve potrdile, da je opažena predelava predhodnika DI poliproteina in vivo res prišla na pričakovanih mestih, ki mejijo na domeno DI.

Vplivi celičnega redoks okolja in kulture na delovanje dvojnega celotnega samodejnega čiščenja

Ker lahko na kinetiko celičnega cepljenja celic vplivata temperatura izražanja in diferenčno celično redoks okolje, smo preučili, kako lahko ti dejavniki vplivajo na predelavo poliproteinov v E. coli, ki jih posreduje DI. Konstruktor reporterja GFP 172 -DI-RFP Strep je bil mobiliziran v E. coli BL21 in SHuffle 28, oblikovan tako, da imata različna celična redoks okolja, in sprožil ekspresijo beljakovin pri dveh različnih temperaturah (25 proti 37 ° C). Naši rezultati so pokazali majhno razliko pri predelavi poliproteinov med obema testiranima sevom (sliki 5a in 5b). Kot je prikazano na slikah 2a in 2b, je bila učinkovita predelava poliproteinov zaznana tudi v celicah HEK293T in tobačnih NT1, ki so imele bolj oksidativno citosolno okolje v primerjavi z E. coli . Zato pri visoko učinkovitih domenah Ssp DnaE in DnaB mini-celin samovšečno delovanje našega sistema DI ni bilo podvrženo razlikam v redoks okolju gostiteljske celice, vsaj znotraj razlik, ugotovljenih pri testiranih gostiteljih.

Image

(a, b) Vpliv celičnega redoks okolja in temperature izražanja na učinkovitost cepitve DI domene. (c) Učinkovitost cepitve C-terminala domene DI v E. coli je bila izboljšana z inkubacijo pri 37 ° C po ekspresiji čez noč pri 25 ° C. (d) Skoraj popolno cepitev smo opazili v 4 urah po inkubaciji pri 37 ° C.

Slika v polni velikosti

Kar zadeva temperaturni učinek, indukcija E. coli čez noč pri 25 ° C ni vplivala na učinkovitost cepitve N-terminala domene DI (slika 5a). Vendar je odkrivanje fragmenta DI-RFP Strep na zahodnem blotu pokazalo manj učinkovito cepitev C-terminala pri 25 ° C, čeprav je pravilno cepljen RFP navzdol po pretoku ostal prevladujoč izdelek na podlagi analize Western blot (slika 5b). Predhodne študije intein kažejo, da so N-terminalni ostanki Cys ali Ser na položaju 1 celote imeli ključno vlogo pri spodbujanju ciklizacije Asna 29 . Po trans (tio) esterifikaciji je stranska veriga osvobojenega N-terminala Cys ali Ser intein nukleofilno napadla škilasto peptidno vez na C-terminalu Asn in tvorila prehodni makrociklični intermediat, ki spodbuja ciklizacijo Asna. Ko smo N-končni nukleofilni ostanek (položaj 1) nadomestili z nefunkcionalnim Ala, smo opazili znižanje stopnje cepitve celic C-terminala 30, 31 . V našem načrtu DI (slika 1b) smo v C-terminalni cepilni inteli ( Ssp DnaB v 1 ) uvedli mutacijo C1A, da bi sprožili reakcijo intein na cepitev C-terminala, s čimer smo odpravili učinek prve nukleofilne stranske verige. V ta namen je bila ciklizacija Asna v glavnem sprožena s protonacijo stranske verige imidazola predzadnje His (poz. 153 DnaB intein) 32, 33 . Atenuirana C-cepilna hitrost cepitve substitucije C1A se lahko kompenzira s povečano hitrostjo hidrolize pri povišani reakcijski temperaturi. V ta namen smo po indukciji čez noč pri 25 ° C celice E. coli resuspendirali v pufru PBS in inkubirali do 37 ur pri 37 ° C. Po približno štirih urah smo opazili skoraj popolno sproščanje RFP Strep iz fragmenta DI-RFP Strep (sliki 5c in 5d). Ta strategija inkubacije po indukciji ponuja rešitev za odpravo učinka oslabljenega cepljenja C-terminala pri nižji temperaturi. Ker je bil v tej študiji testiran samo inteli Ssp DnaB kot C-terminalna cepitvena domena, bi lahko to intein nadomestil drug intein, ki je sposoben bolj aktivnega cepitve C-terminala. O takih različnih variantah so poročali, na primer Ramirez et al. 34 .

Karakterizacija beljakovin, ki se sprostijo iz dvojnega intein predhodnika poliproteina

Da bi ugotovili, ali beljakovine, ki se sproščajo iz predhodnika poliproteina, ostanejo funkcionalne, smo s fluorescentno mikroskopijo preučili transgene celice, ki izražajo poročevalca GFP 172 -DI-RFP Strep . Kot je prikazano na sliki 6a, je bila v vseh testiranih celičnih linijah vidna svetlo zelena in rdeča fluorescenca, ki se razlikuje od avtofluorescence v ozadju. Ti rezultati so v primerjavi s podatki o Western blotu (slika 2), ki so pokazali v bistvu popolno cepitev predhodnika poliproteina, pokazali, da fluorescenca, odkrita v transgenih celicah, izvira iz predelanih beljakovin, zato so ti proteini resnično funkcionalni. Kot stransko opombo je na slikah rastlinskih celic na sliki 6a vidna nekoliko drugačna porazdelitev GFP in RFP. Za razliko od citoplazemske porazdelitve RFP fluorescence je bil GFP nagnjen k akumulaciji tobačnih celic v jedrskem območju, čeprav v njegovem zaporedju 35, 36 ni bil prepoznan noben jedrski lokalizacijski signal. Za jedrsko lokalizacijo GFP je prišlo zaradi pasivne difuzije skozi jedrske pore zaradi njihove nizke molekulske mase 36, 37 . Ko se znotraj jedra GFP oligomerizira v velike homomultimere za visoko lokalno koncentracijo, ujame GFP na jedrski meji in vodi ravnotežje proti uvozu jedra 36 . Po drugi strani pa RFP (mCherry) nagiba k ohranjanju monomerne strukture in prosto giblje skozi jedrske pore. Nadaljnja analiza transgenih celičnih izvlečkov s fluorescentno spektrometrijo je pokazala emisijske spektre, značilne za GFP in RFP (mCherry), kar kaže, da ne samo sproščeni GFP in RFP kažeta fluorescenco, na spektralne lastnosti sproščenih fluorescentnih beljakovin DI-posredovani niso vplivali in vivo cepitev (slika 6b).

Image

(a) Celice, ki izražajo konstruktor poročevalca GFP 172 -DI-RFP Strep, prikazujejo tako zeleno (zgornja plošča) kot rdečo (spodnja plošča) fluorescenco. Lestvica: 50 µm. (b) GFP 172 in RFP Strep, sproščena iz predhodnika poliproteina, delujeta, kot kažeta njuni spektralni spektri fluorescenčne emisije.

Slika v polni velikosti

Pri so-ekspresiji z več proteini je pomembno, da lahko nadzorujemo relativno stehiometrijo genskih produktov. Da bi ugotovili, ali je mogoče s pomočjo poliproteinskega pristopa DI doseči stehiometrično kopičenje sestavnih proteinov, smo celično akumulacijo cepljenega GFP in RFP analizirali s skeniranjem denzitometrije zahodnih blotov, skupaj s količinsko določitvijo beljakovin na podlagi meritve fluorescence. Kot je prikazano na sliki 7, so bile v celicah sesalcev HEK293T opažene približno enake molarne kopičenja predelanih GFP 172 in RFP Strep . Vendar je bila proizvodnja GFP 172 približno 50% manjša od RFP Strep v E. coli BL21, ki je bila inducirana pri 37 ° C. Varianta GFP 172 je vsebovala interno zaporedje heksa-histidina, vstavljenega med ostanke 172 in 173 GFP, in v naši prejšnji študiji smo ugotovili, da se je E. coli zvišala manj učinkovito pri 37 ° C kot pri 25 ° C. 22 Ko je GFP z oznako C-konca His (GFPHis), ki se dobro segreje pri 37 ° C, zamenjal GFP 172 v poliproteinskem vektorju, je prišlo do skoraj ekvimolarnega kopičenja GFP His in RFP Strep (sl. 7). Ta rezultat ponazarja dejstvo, da bi lahko post-translacijska sprememba in / ali diferencialna stabilnost beljakovin igrala tudi vlogo pri odločanju o relativni ravni kopičenja sestavnih beljakovin, sproščenih iz poliproteina. Za beljakovine s podobno stabilnostjo ali zložljivo učinkovitostjo smo tukaj pokazali, da bi bilo mogoče stehiometrično proizvodnjo doseči v E. coli s sistemom vektorskih poliproteinov DI, ko je bil GFP His uporabljen za nadomestitev zgornjega toka GFP 172 . Takšna stehiometrična ekspresija je pomembna lastnost, zaradi česar je sistem poliproteinov DI boljši od ekspresijskih vektorjev, ki vsebujejo več monocistronskih ekspresijskih kaset. V ta namen smo opazili, da se ravni proteinov GFP 172 in RFP Strep razlikujejo za več kot 10-krat, ko so ekspresionirane z vektorjem pSKDuet01 (Addgene plazmid 12172), ki izhaja iz pRSFDuet-188, ki vsebuje dve ekspresijski kaseti (sl. 7 ).

Image

Slika v polni velikosti

V celicah HEK293T sesalcev se je GFP 172 navidezno zložil relativno učinkovito pri 37 ° C in dosegel skoraj podobne stopnje izražanja kot RFP Strep (slika 7). V rastlinskih gostiteljih se je za nediferencirane gojene tobačne celice in listna tkiva transgenega tobaka nabiral RFP Strep v manjši količini kot GFP 172 . Kot je razloženo zgoraj, smo v celicah E. coli, gojene pri nižji temperaturi (npr. Pri 25 ° C), opazili upad cepljenja celic C-terminala. To oslabljeno učinkovitost cepitve je verjetno povzročila intrinzična mutacija C1A v mini-celinski domeni Ssp DnaB, ki je na temperaturno odvisen način znižala hitrost reakcije C-terminalne ciklizacije Asn. Tako bi lahko podobno zmanjšanje cepljenja C-terminala pričakovali tudi pri rastlinah, ki po možnosti rastejo pri sobni temperaturi. Neuspeh pri odkritju necepljenega fragmenta DI-RFP Strep v rastlinskih izvlečkih z Western blot je nakazal njegovo razgradnjo znotraj celic.

Za nadaljnjo dokazovanje splošne uporabnosti sistema vektorskih poliproteinov za multi-proteinsko so-ekspresijo so gorvodni GFP 172 in nizvodno RFP Strep zamenjali C-terminalni njegov označeni tioredoksin (Trx His ) in C-terminal Strep, označen s kloramfenikol acetiltransferazom (CAT Strep ), torej za ustvarjanje konstrukcij Trx His -DI-RFP Strep in GFP 172 -DI-CAT Strep . Kot sta razkrila Western blot anti-His in anti-Strep tag, je bila v obeh primerih dosežena visoko učinkovita obdelava prekurzorjev poliproteina v bistvu s popolnim sproščanjem sestavnih proteinov v E. coli BL21 (slika 8). Biološka aktivnost sproščenega encima CAT je bila potrjena tudi z encimskim testom. Na podlagi skeniranja denzitometrijske analize zahodnih blotov je bilo ugotovljeno, da se Trx His in RFP Strep kopičijo na približno ekvimolarne količine v celicah E. coli, ki izražajo Trx His -DI-RFP Strep . Kar zadeva strežni vektor GFP 172 -DI-CAT, se je GFP 172 nabral v manjši količini kot CAT Strep, kar se je najverjetneje pripisalo manj učinkovitemu zgibanju GFP 172 v E. coli BL21 pri 37 ° C, kot je razloženo zgoraj . Kljub temu, ko se je E. coli transformirala z GFP 172 -DI-CAT Strep vektorjem čez noč pri 25 ° C, je molsko razmerje med GFP 172 in CAT Strep postalo zelo blizu enoti . Ti rezultati kažejo na potencialno univerzalno uporabnost DI-poliproteinskega vektorskega sistema za multi-proteinsko koekspresijo, saj je aktivnost samokoličenja Fusion domene očitno precej neobčutljiva na beljenje beljakovinskih zaporedij.

Image

Učinkovito sproščanje beljakovinskih sestavin iz poliproteinov GFP 172 -DI-CAT Strep in Trx His6 -DI-RFP Strep je bilo ugotovljeno z uporabo (a) oznake anti-His in (b) anti-Strep tag Western blots.

Slika v polni velikosti

Ravni proteinske ekspresije z uporabo dvojnih intein poliproteinskih vektorjev

Količine GFP 172, ustvarjene z vektorjem DI-poliproteina (kodira GFP 172 -DI-RFP Strep ), smo primerjali s količinami, ki uporabljajo vektorje, ki vsebujejo bodisi eno samo nefuzno GFP 172 bodisi ločeno ekspresijsko kaseto GFP 172 in RFP Strep pod nadzorom isti promotor. Ta primerjava je bila izvedena v E. coli in tobačnih NT1 celicah z uporabo T7 in (oc) 3 / mas promotorja. Raziskali smo E. coli BL21 (DE3) in sev SHuffle 28 za ekspresijo GFP 172 iz vektorja poliproteina DI v primerjavi z vektorjem pSKDuet (sorazmerno GFP 172 in RFP Strep iz ločenih monocistronskih kaset na istem vektorju). Sev SHuffle konstitutivno izraža DsbC, ki je izulfidna disulfidna vez, ki je znana kot kaperon, ki pomaga pri zvijanju beljakovin 38 . Zanimivo je, da je medtem ko je izražanje GFP 172 nižje, kadar je izraženo z uporabo vektorja DI kot pri uporabi pSKDuet v BL21 (DE3) pri 37 ° C, trend obrnjen pri 25 ° C tako pri BL21 kot pri SHuffle. Pri 37 ° C v sevu SHuffle je izražanje GFP 172 podobno z uporabo vektorja DI ali pSKDuet (dodatna slika S2). Poročalo se je, da koekspresija chaperona povzroča proteolitično razgradnjo beljakovinskih vrst 39, ki se zlagajo, kar bi lahko razložilo nizke stopnje ekspresije, opažene v sevu SHuffle pri 37 ° C, saj je znano, da se GFP 172 manj učinkovito zloži kot običajni GFP pri ta temperatura 22 . Nižja ekspresijska temperatura (25 ° C) je olajšala zlaganje GFP 172 in domene DI v obeh sevih.

V tobaku je GFP 172 dosegel 0, 28% in 0, 04% celotnih topnih beljakovin (TSP), ko smo ga izrazili iz poliproteinskega vektorja GFP 172 -DI-RFP Strep v celicah NT1 in v listih tkiva N. tabacum . Za primerjavo, je ekspresija GFP 172 ali RFP Strep sama z istim (oc) 3 / mas promotorjem v transgenih celicah NT1 tobaka dosegla približno 0, 29% oziroma 0, 61% TSP. Čeprav je treba preskusiti več beljakovin, spodbudni rezultati izražanja beljakovine poročevalcev kažejo, da bi lahko na osnovi DI poliproteinski vektorski sistem ustvaril primerljivo raven rekombinantnih beljakovin kot pri običajnih vektorjih z enim proteinom.

Aktivnost samodejne obdelave domene DI brez njenega razširitvenega veznika N-terminala

V zgoraj predstavljenih podatkih uporabljena domena DI vsebuje razširitev N-terminala, ki izhaja iz naravnega zaporednega zaporedja N-ekstenzije celine Ssp DnaE, ​​vendar z mutacijami na položajih N-1 in N-2 do Asp in Asn (sl. 4c). Ta razširitev povezovalnika je bila vključena z namenom pospešiti samodejno čiščenje na N-terminalu domene DI 20 . Medtem ko je ta različica domene DI posredovala zelo učinkovito samoreženje, kot je predstavljeno v prejšnjih razdelkih, smo naknadno potrdili, da je mogoče z odstranitvijo podaljška DI N-terminala doseči primerljivo samoreženje. Kot je prikazano v rezultatu Western blot, predstavljenem na dodatni sliki S3, koekspresija GFP 172 in RFP Strep z uporabo poliproteinskega vektorja, ki vsebuje spremenjeno domeno DI, ki izpušča njeno N-terminalno podaljšanje zaporedja, tj. LEGGSKFAND (prim. Sliko 4c), privedla do zelo učinkovitega sproščanja tako GFP 172 kot RFP Strep . Ta rezultat je racionalen, saj je znano, da ključni ostanki, ki sodelujejo v celovitem samodejnem odstranjevanju N-terminalov, prebivajo v notranjosti in takoj po celotnem zaporedju 19 . V tem primeru na POI, ki se sprosti iz N-terminala domene DI, niso dodane tuje aminokisline. Kar zadeva spodnji tok POI, potem ko se sprosti iz predhodnika poliproteina in po čiščenju lahko aminokislinski previs na njegovem N-koncu odstranimo, da ohranimo njegov pristni N-terminalni ostanek z uporabo primerne amino-peptidaze. Kot primer je mogoče razmisliti o komercialno dostopnem sistemu TAGZyme, ki temelji na uporabi dipeptidil aminopeptidaze I (DAPase Enzyme) v kombinaciji z glutamin ciklotransferazom (encifom Qciklaza) in piroglutamil aminopeptidazo (pGAPase Encim) (Qiagen). V ta namen je pred matičnim ostankom N-terminala treba uvesti DAPazno končno točko (npr. Ostanek Gln). Upon removal of the first N-terminal dipeptide, DAPase removes dipeptides progressively till it encounters the Gln stop point which is then removed by Qcyclase and pGAPase 40 .

Autoprocessing of polyprotein containing a single intein domain

In principle, self cleavage on both ends of an intein may be achievable by promoting hydrolysis of the linear (thio)ester intermediate and allowing more efficient intein C-terminal Asn cyclization 30 . It has been suggested that release of both N- and C-exteins from a single intein without subsequent extein splicing could occur by mutating the essential residue at position +1 (flanking the intein C-terminus) to Gly or Ala 30 . Here we investigated whether co-cleavage at both splicing junctions of a single intein with such mutation can result in efficient release of flanking POIs as in the case of DI-based vectors. A polyprotein construct that encodes an Ssp DnaE mini-intein with C + 1A mutation sandwiched between a GFP 172 and a mCherry was created and expressed in E. coli BL21(DE3). Cell extract was probed with western blot. As shown in Supplementary Fig. S4, a substantial portion of uncleaved or partially cleaved polyprotein fragments was detected on western blots of the E. coli extract, while only a small portion (about 10%) resulted from co-cleavage at both ends of the intein. By comparing this result with that shown in Supplementary Fig. S3 for a DI-based polyprotein system, it is clear that the DI domain is necessary to confer hyperactive autocleavage of the polyprotein precursor to achieve highly efficient release of the POIs.

Advantages and limitations of the DI polyprotein system

In this study we demonstrated that incorporation of an engineered DI domain in a polyprotein system enabled highly efficient synchronized protein co-expression from a single ORF in different expression host systems. This approach has a number of unique advantages over existing methods. The DI system is based on sequences of non-viral origins and hence avoids biosafety, environmental, and compliance issues. The highly efficient and rapid in vivo protein processing is autocatalytic and it does not require host-specific factors. Since the multiple POIs are encoded by a single ORF, it potentially allows control over the relative stoichiometry of the gene products to achieve a balanced multi-protein synthesis, especially when the POIs have similar folding and stability characteristics. The DI technology is applicable to both prokaryotic as well as eukaryotic hosts. By integrating with homologous recombination-based cloning methods such as the popular Gateway technology, the new DI polyprotein cassette can be easily shuttled between different hosts for expression. On the downside, with the DI based polyprotein vector the multiple POIs are expressed from the same promoter and thus if expression of each POI needs to be driven by a different promoter, eg for expression in different tissues or be expressed at different times, the DI polyprotein vector will not be well suited. Overall, the DI based polyprotein approach has many unique features and is also highly complementary to existing protein expression techniques, and hence it is a highly valuable addition to the molecular toolbox for synchronized multi-protein co-expression.

Metode

Vektorska konstrukcija

The Dual-intein (DI) polyprotein cassettes were cloned into different vectors for expression in E. coli , mammalian HEK293T, and tobacco NT1 cells, respectively. To assemble the GFP 172 -DI-RFP Strep cassette, first the coding sequence of Ssp DnaE mini-intein (DnaE) N159A variant flanked by five bordering N-extein residues (KFAND) reported to accelerate N-terminal cleavage 20 and three native C-extein (CFN) residues was synthesized by Genscript (Piscataway, NJ) and ligated into pUC57 between Xho I and Xba I sites to yield pUC-DnaE(A 159 CFN) vector. The coding sequence for GFP 172 (a modified mGFP5 with six histidine residues inserted between amino acid residues 172 and 173) 22 was amplified from pGEM5z-GFP172 incorporating Sal I and Xho I sites by forward ( Sal I-mGFP5) and reverse primers (GFP- Xho I-R), respectively. mCherry coding region was amplified from pETMD 41 to incorporate a 5′- ApaI site and a Strep tag followed by a Sac I site at the 3′-end by two step overlap PCR with the forward primer (mCherry-2A-F1) and reverse primers (mCherry-Strep and GKZ-R). C-terminal cleaving Ssp DnaB mini-intein (DnaB) with three native bordering N-extein residues (ESG) and C-terminal cleavage accelerating C-extein residues (SR) 21 was amplified from pTWIN1 (New England Biolab, Ipswich, MA) with primer pairs (DnaB- XbaI -F/DnaB-SRGP-R) incorporating Xba I and Apa I flanking the 5′- and 3′- junctions, respectively. PCR fragments of GFP 172, DnaB mutant and mCherry-Strep tag were successively ligated into pUC57-DnaE backbone after digestion with respective restriction enzymes to yield pUC-GFP 172 -DnaE-DnaB-mCherry-strep (called pUC-GFP 172 -DI-RFP Strep hereinafter). To replace GFP 172 with GFP His (mGFP5 with C-terminal hexa His tag) in pUC-GFP 172 -DI-RFP Strep, GFP His coding sequence was amplified from pBISN1-mGFP5-ER using primers GFP- KpnI -F and mGFP5-His- XhoI -R to incorporate KpnI and XhoI sites at the 5′- and 3′-ends, respectively, and replaced the KpnI -GFP 172 - XhoI fragment in pUC-GFP 172 -DI-RFP Strep to yield pUC-GFP His -DI-RFP Strep . To assemble a vector for expressing thioredoxin-DI-mCherry (Trx His -DI-RFP Strep ) in E. coli , the DI-RFP Strep fragment from pUC-GFP 172 -DI-RFP Strep was amplified using PCR primers Kpn I-DnaE-F and GKZ-R to incorporate Kpn I and Sac I sites at the 5′- and 3′-ends, respectively. The PCR fragment was digested with Kpn I/ Sac I and ligated into Kpn I/ Sac I digested pET32a vector for in-frame fusion with an upstream thioredoxin sequence to create pET-Trx His -DI-RFP Strep .

For protein expression, the assembled GFP 172 -DI-RFP Strep cassette was mobilized into pET vector. In doing so, Nde I site within the GFP 172 coding region was removed by silent mutation using overlap PCR with primers Nde I-G172-F/Nd172R and Nd172F/G172- Kpn I-R. The modified GFP 172 incorporating a 5′- Nde I and a 3′- Xho I site was subsequently cloned into pET-Trx His -DI-RFP Strep vector to replace the upstream thioredoxin, yielding pET-GFP 172 -DI-RFP Strep . To replace the downstream RFP Strep protein in DI polyprotein to CAT Strep, CAT Strep coding sequence was amplified from pET-CAT vector by two step PCR using forward primer (CAT-2A-F1) and reverse primers (CAT-STREP-R and GKZ-R) incorporating Apa I and Sac I at 5′- and 3′- end, respectively, and replaced the Apa I-mCherry-streptag- Sac I fragment in pET-GFP 172 -DI-RFP Strep to create pET-GFP 172 -DI-CAT Strep . To eliminate the C-terminal overhang on the upstream POI, the N-extein linker extension sequence (LEGGSKFAND) preceding the DI domain in the GFP 172 -DI-RFP Strep polyprotein was removed by mutating the pET-GFP 172 -DI-RFP Strep vector via inverse PCR using primer pair G172-DnaE-F and G172-DnaE-R. The amplified plasmid pET-GFP 172 -DI(−)-RFP Strep was transformed into E. coli DH5α after Dpn I enzyme treatment. To compare protein expression using our DI polyprotein system with the commercial vector incorporating multiple monocistronic expression cassettes, GFP 172 and RFP Strep were inserted into the first and the second multiple cloning sites of the pSKDuet01 vector (Addgene plasmid 12172), respectively. To do so, RFP Strep fragment was PCR amplified from pETMD vector using forward primer (XBF) and reverse primer (MBR) containing a 5′- Nde I and a 3′- Bam HI, respectively. Amplified Nde I-RFP Strep - Bam HI fragment was ligated into pSKDuet01 vector digested with the corresponding restriction enzymes, to yield pSKM. GFP172 incorporating a Sac II site and a Sac I site at the 5′- and 3′-ends, respectively, was amplified from pGEM5z-GFP172 vector using primers GFS2 and GRS. The resulting Sac II-GFP 172 - Sac I fragment was ligated into pSKM vector digested with Sac II and Sac I enzymes to yield pSKGM. To compare the co-cleavage efficiency at both N- and C-termini of our DI fusion domain with the single intein incorporating the C + 1A mutation, Xho I-Ssp DnaE(A 159 CFN)- Xba I fragment in pUC-DnaE(A 159 CFN) vector was replaced with Xho I-Ssp DnaE(N 159 AFN)- Xba I which was amplified using primers Xho I-Int-F and DnaENAFN- Xba I-R, to yield pUC-DnaE(N 159 AFN). The resulting Xho I-Ssp DnaE((N 159 AFN)- Xba I fragment along with a C-terminal linker sequence was excised from pUC-DnaE(N 159 AFN) vector between Xho I and Apa I sites and was subsequently used to replace the DI fragment in pUC-GFP 172 -DI-RFP Strep vector, to yield pUC-GFP 172 -Int-RFP Strep .

The cleavage-inactive DnaE intein mutant was generated using primers (IDnaE- Kpn I-F/DnaE- Xba I-R-2) that carry the C1A mutation (in addition to the N159A mutation). This inactive DnaE replaced its active counterpart in pET-GFP 172 -DI-RFP Strep to create pET-GFP 172 -DI(N-)-RFP Strep that encodes an N-(cleavage) inactive DI polyprotein. Here, the N-extein and C-extein residues flanking the inactive DnaE were changed to EY and GG, respectively, to minimize any cleaving activity. Similarly, cleavage-inactive DnaB intein mutant was generated using primers (DnaB- Xba I-F/IDnaB- Apa I-R) that contains N154A mutation (in addition to the C1A mutation). In addition, C-extein residues bordering DnaB were changed from SR to GS. The inactive DnaB fragment was digested with Xba I/ Apa I, and ligated into the pET-GFP 172 -DI-RFP Strep vector digested with the corresponding restriction enzymes, yielding a vector pET-GFP 172 -DI(C-)-RFP Strep that encodes a C-(cleavage) inactive DI polyprotein.

For tobacco NT1 cell transformation, coding sequence of GFP 172 -DI-RFP Strep was inserted between Sal I and Sac I sites in the binary vector pE1775 under the control of the mannopine/octopine synthase (ocs) 3 /mas promoter 25 . For mammalian HEK293T transient expression, GFP 172 -DI-RFP Strep fragment was PCR amplified using primers Sac I- Nhe -DI-F3 & Strep- Not I-R to incorporate Sac I and Not I at 5′- and 3′- ends, respectively, and inserted into pcDNA3.1 vector at the corresponding digested sites.

Expression in Escherichia coli

The pET vectors encoding DI-polyprotein sequences were transformed into E. coli BL21(DE3). Bacterial cells were cultured at 37°C except when indicated otherwise. Protein expression was induced with 0.1 mM of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) when cells were grown to an OD 600 of 0.5. In addition to E. coli BL21(DE3), protein expression was performed in SHuffle E. coli strain (New England Biolab, Ipswich, MA) lacking the trxB and gor reductases along with an additional suppressor mutation (ahpC) which restores viability 28 . These mutations lead to an altered redox state in the SHuffle cells to permit oxidative folding. Upon completion of induction, cells were pelleted by centrifuging at 6000 × g for 5 min, and then rinsed using phosphate buffer saline for three times. Washed cell pellets were disrupted by ultrasonication at 5 Watt for 5 min in PBS protein extraction buffer (20 mM sodium phosphate pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 200 μM lysozyme, 1 μg/ml leupeptin, 100 ng/ml pepstatin). Total soluble proteins were obtained by centrifuging for 15 min at 14, 000 × g at 4°C and used in subsequent analysis.

Mammalian HEK293T cell transfection, protein expression, extraction, and analysis

DI mediated polyprotein processing in mammalian system was tested in human embryonic kidney (HEK293T) cells. HEK293T cells were cultured in DMEM medium (Invitrogen, Grand Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 50 mg/L penicillin-streptomycin, and incubated at 37°C under 5% CO 2 . Transient transfection was performed using Xtreme Gene 9 (Roche, Indianapolis, IN) when the cell density reached 70–90% confluency, by following the product instruction. The transfection complex was subsequently transferred to 3 ml of HEK293T culture. After 24 hour of incubation at 37°C under 5% CO 2, transfected cells were washed and resuspended in PBS protein extraction buffer, and then lysed by ultrasonication at 5 watt on the ice for 5 min to extract the total soluble protein. Protein extract was clarified by centrifugation at 14, 000 × g at 4°C for 15 min and subjected to subsequent analysis.

Tobacco transformation and protein characterization

The GFP 172 -DI-RFP Strep polyprotein binary vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens C58C1 by electroporation. After PCR confirmation, transformed Agrobacteria was co-cultivated with the tobacco NT1 cells or tobacco leaves ( N. tabacum cv Xanthi) using a modified protocol reported previously 42, 43 . The resultant transformants were selected on MS agar media 44 supplemented with hygromycin. The high expressing lines, screened based on GFP fluorescence and western blot analysis, were selected for subsequent characterization. Transient expression was performed in leaf tissues of N. benthamiana and Romaine lettuce via vacuum assisted agroinfiltration as described in previous publication 45 . Protein extraction from transgenic tobacco was carried out by following a previously published protocol 46 . Clarified supernatants were used for subsequent western blot, protein, fluorescence analysis, and chromatographic purification. Fluorescence measurement was performed using a Hitachi F-2500 fluorescence spectrophotometer with excitation at 470 and 575 nm for detection of GFP and mCherry fluorescence, respectively. Amount of GFP and mCherry was estimated based on the fluorescence calibration curve established using purified protein standards.

Purification of cleaved GFP 172 for ESI-TOFMS analysis

Crude protein extracts from transgenic tobacco NT1 calli were pre-clarified by 30% ammonium sulfate precipitation before applying onto a Phenyl-Sepharose hydrophobic-interaction column (GE Healthcare, Piscataway, NJ) connected to a Biologic Duo Flow chromatography system (Bio-Rad, Hercules, CA). The loaded column was rinsed with a washing buffer (20 mM sodium phosphate pH 8.0, 1 M ammonium sulfate), and eluted with a linear gradient from 1 M to 0 M ammonium sulfate over 20 column volumes. Fractions with GFP fluorescence were subsequently purified with a HiTrap IMAC-Sepharose column (GE Healthcare, Piscataway, NJ) by washing with a binding buffer (20 mM sodium phosphate pH 7.4, 500 mM sodium chloride and 20 mM imidazole) and eluted with a linear gradient from 20 mM to 500 mM imidazole over 12 column volumes. Fractions containing GFP fluorescence were concentrated and desalted with a Zeba desalting spin column (Thermo Fisher., Rockford, IL) for electrospray time-of-flight mass spectrometry (ESI-TOFMS) analysis on an Agilent 6210 LC-TOFMS system fitted with an ESI source operated in positive ion mode as described previously 45 .

Purification of cleaved RFP Strep

Cleaved RFP Strep was purified with a Strep-Tactin Superflow Plus 2 ml column according to the manufacture manual (Qiagen, Valencia, CA). Briefly, the column was charged with crude soluble protein extracts from transgenic tobacco NT1 cells then washed with NP buffer (50 mM sodium phosphate pH 8.0, 300 mM sodium chloride), followed by elution with NPD buffer (NP buffer containing 2.5 mM desthiobiotin). The fractions shown mCherry fluorescence were concentrated for N-terminal amino acid sequencing.

N-terminal amino acid sequencing

The GFP 172 and RFP Strep liberated from the polyprotein precursor were purified by chromatography as described above, followed by separation on SDS-PAGE and transferred onto a PVDF membrane. The target band with the expected size was excised out after staining with Coomassie blue. The N-terminal sequencing was performed using Edman degradation on a Perkin Elmer Applied Biosystems Procise 494 protein/peptide sequencer coupled with an on-line Perkin Elmer Applied Biosystems Model 140C PTH Amino Acid Analyzer (Applied Biosystems, Calsbad, CA), performed by the Protein Core Facility at the Iowa State University.

Additional methods

Detailed methodology of gel electrophoresis, western blot analysis, and CAT assay, along with a list of primers used in cloning can be found in the Supplementary Information.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dodatne informacije

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.