Dejavnik, ki veže dna ctcf, kritično nadzira ekspresijo genov v makrofagih | celična in molekularna imunologija

Dejavnik, ki veže dna ctcf, kritično nadzira ekspresijo genov v makrofagih | celična in molekularna imunologija

Anonim

Izvleček

Makrofagi igrajo pomembno vlogo pri imunosti in homeostazi. Ko prepoznajo patogene prek specifičnih receptorjev, hitro sprožijo vnetne odzive. Ta postopek je strogo nadzorovan na ravni transkripcije. CCCTC-vezni faktor (Ctcf), ki veže DNA, je ključni regulator dolgoročnega delovanja kromatina in koordinira specifično komunikacijo med transkripcijskimi faktorji in procesi genske ekspresije. V tej študiji je bil gen Ctcf posebej izbrisan iz mieloidnih celic z uporabo transgenega sistema Cre-LoxP. Pogojna delecija gena Ctcf v mieloidnih celicah je in vivo povzročila blag fenotip. Pri miših s pomanjkanjem Ctcf je bila v jetrih izrazito zmanjšana ekspresija glavnega kompleksa histokompatibilnosti (MHC). Makrofagi s pomanjkanjem Ctcf so pokazali normalen površinski fenotip in fagocitozo. Po stimulaciji celičnega receptorja (TLR) so proizvajali normalne ravni provnetnih citokinov IL-12 in IL-6, vendar so pokazali močno oslabljeno sposobnost za tvorbo tumorsko-nekrotičnega faktorja (TNF) in IL-10. kot izraz IL-10 družinskih članov IL-19, IL-20 in IL-24. Naši podatki skupaj vsebujejo vlogo Ctcf, ki vključuje natančno nastavitev funkcije makrofagov.

UVOD

Celice, ki pripadajo mieloidni rodu, igrajo osrednjo vlogo pri homeostazi in imunosti ter sodelujejo pri uvedbi, vzdrževanju in reševanju imunskih odzivov. Mieloidne celice vključujejo granulocite, monocite, dendritične celice in makrofage. 1 Te celice preko širokega nabora receptorjev za prepoznavanje vzorcev prepoznajo bakterije, viruse ali apoptotične celice, da sprožijo svoje efektorske funkcije, kar vodi do izločanja bakterij in virusov ali odstranitve apoptotičnih celic. 1 Prepoznavanje prek specifičnih receptorjev, kot so celični receptorji (TLR), in fagocitni vnos patogenov z makrofagi ali dendritičnimi celicami (DC) na splošno povzroči nastajanje in izločanje protivnetnih citokinov, kot je tumor-nekrozni faktor (TNF), IL-6 ali IL-12, ki sprožijo in spodbujajo obrambo gostitelja. Ekspresija citokinov je na splošno inducirana in je lahko specifična za celice. 2 Vnetni odzivi, potrebni za odstranjevanje patogenov, so izredno zapleteni in strogo nadzorovani na ravni genske transkripcije. Transkripcijski programi morajo sprožiti učinkovit odziv efektorja, ki nadzoruje škodljiv izziv gostitelja.

DNK-vezavni CCCTC vezni faktor (Ctcf) ima pomembno vlogo pri uravnavanju ekspresije številnih genov in približno 14 000–40 000 vezavnih mest je bilo ugotovljenih v genomu. 3, 4 Ctcf je zelo ohranjen 11-cinkov prstni protein, ki sodeluje pri uravnavanju genske ekspresije na način, ki je specifičen za celico, pri kompleksnih genskih grozdih, kot so β-globin, glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) in gen Ig loci. 3, 4 Poleg tega je Ctcf pomemben pri številnih regulativnih funkcijah, vključno z genomskim odtisom, inaktivacijo X-kromosoma in medsebojnimi kromatinskimi interakcijami, dušenjem gena, odzivnim na hormone, blokatorjem ojačevalca in / ali izolacijo genskih zapor in transkripcijskim aktiviranjem ali zatiranjem. 3, 4 Različne funkcije Ctcf se izvajajo s kombinirano uporabo 11-cinkovih prstov, ki mu omogočajo, da veže zelo različna zaporedja. 3 Ctcf uravnava kromatinsko arhitekturo skupaj s kohezijskimi proteini, ki so obogateni na mestih, ki vežejo Ctcf. 5, 6, 7 Poleg tega več funkcij Ctcf omogoča interakcija z različnimi vezalnimi partnerji, kot so transkripcijski faktorji (Yy1, Kaiso in YB-1), proteini, ki spreminjajo kromatin 8, 9, 10 (Sin3a, CHD8, Suz12), 11, 12, 13 RNA polimeraza II 14 in poli (ADP-riboza) polimeraza-1. 15

Pred kratkim so ugotovili, da Ctcf nadzira ekspresijo genov razreda MHC, 16, poročali pa so, da je vsiljena prekomerna ekspresija Ctcf v DC povzročila povečano apoptozo, zmanjšano proliferacijo in oslabljeno diferenciacijo. 17 Poskusi s pogojnim targetiranjem na miših so pokazali, da Ctcf nadzoruje tako razvoj T-celic 18 kot diferenciacijo v podmnožice efektorjev, zlasti v pomožne skupine T (Th) -2. 19 Prej smo poročali, da imajo miši z napako Ctcf v celicah CD4 + T zmanjšan razvoj Th2 in produkcijo Th2 citokinov IL-4, IL-5 in IL-13, kljub izraziti normalni ravni ključnih transkripcijskih faktorjev Th2 Gata3 in Satb1. 19 Zanimivo je bilo, da je za ekspresijo IFN-γ, specifično za celico Th1, potrebno sodelovanje med T-betom in Ctcf. 20 Poleg tega Ctcf igra tudi vlogo pri uravnavanju dogodkov rekombinacije V (D) J in uporabe gena V v verigah Ig H in L v B celicah. 21, 22 Vloga Ctcf pri razvoju in delovanju mieloidnih celic in vivo ni bila raziskana. Tu smo uporabili transgeni sistem Cre-loxP za generiranje pogojnih mieloidno specifičnih Ctcf -knockout miši, ki omogočajo analizo vloge Ctcf pri razvoju in delovanju makrofagov in vivo in in vitro . Dokazujemo, da je brisanje gena Ctcf v celicah z aktivno ekspresijo Cre, ki jo poganja promotor M lizocima (LysM), vplivalo na število makrofagov, ustvarjenih iz monocitov. Zanimivo je, da smo opazili, da makrofagi s pomanjkanjem Ctcf iz miši LysM-Cre Ctcf f / f ohranijo sposobnost proizvodnje IL-6 in IL-12 po TLR ligaciji, vendar kažejo oslabljeno izražanje ali proizvodnjo regulativnih citokinov iz družine IL-10 pa tudi TNF.

REZULTATI

Črtanje gena Ctcf v subpopulacijah makrofagov

Da bi preučili vlogo Ctcf v liniji mieloidnih celic in vivo , smo križali miši, ki so nosile Ctcffloxed alel 18, 23 s transgeničnimi mišmi LysM-Cre , ki izražajo rekombinacijo Cre pod nadzorom promotorja LysM, 18, 23 s tem omejevanje deleža Ctcf gena na mieloidne celice.

Najprej smo potrdili, da se transgen LysM-Cre funkcionalno izraža v različnih populacijah makrofagov z uporabo mišjega seva Cre-reporter, ki vsebuje ciljno vstavitev EYFP v lokus ROSA26. 24 Našli smo veliko EYFP izražanja v CD11b + F4 / 80 visokih peritonealnih in vranicnih makrofagih, pa tudi v kupčevih celicah CD11b + F4 / 80 v jetrih, čeprav so bile v vseh teh oddelkih tudi EYFP-negativne celice (slika 1a ).

Image

LysM promotor je aktiven v makrofagih in poganja Ctcf delecijo v makrofagih pri miših LysM-Cre Ctcf f / f . ( a ) Reprezentativni pretočni citometer in histogram za vizualizacijo aktivnosti LysM promotorja pri miših LysM-Cre Rosa-EYFP. Peritonealni in vranici makrofagi ter Kupfferjeve celice so bili identificirani kot CD11c z nizko količino CD11b + F4 / 80 + . Izraz EYFP je posledica brisanja Cre-rekombinaze, ki ga poganja LysM, fragmenta 'floxed-stop' gorvodnega EYFP. Pretočna citometrična analiza kaže, da so ∼ 80%, ∼ 35% in ∼ 70% peritonealni in vranici makrofagi oziroma Kupfferjeve celice EYFP +, kar kaže na aktivnost LysM v teh populacijah makrofagov. ( b ) Oblikovno F4 / 80 in obarvanje s hematoksilinom jeter prostoživečih živali. Za jedra hepatocitov je značilna velika velikost in okrogla oblika. Poleg tega opazimo majhna in podolgovata jedra, od katerih je expression 70% povezanih z izražanjem F4 / 80. ( c ) Reprezentativno obarvanje jeter divjih vrst in živali LysM-Cre Ctcf f / f z nuklearnim Ctcf in hematoksilinom. Jedrska ekspresija Ctcf, opažena kot rjavo obarvanje, je v celicah, ki niso hepatociti LysM-Cre Ctcf f / f , šibkejša v primerjavi z živalmi divjega tipa. Ctcf, CCCTC-vezavni faktor; EYFP, okrepljen rumeni fluorescentni protein; LysM, lizocim M.

Slika v polni velikosti

Homozigotne miši LysM-Cre Ctcf f / f so bile videti normalne in rodovitne ter so se rodile pri pričakovanih frekvencah na podlagi Mendeljeve dednosti. Delecijo Ctcf gena smo nadzirali z izražanjem bakterijske bakterije β-galaktozidaze ( lacZ ), ki je bila prisotna v floxnem alelu Ctcf . 18 Kot smo pričakovali, 23 smo našli izražanje lacZ , ki ga je zaznaval fluorescein-di-β-d-galaktopiranonosid v povezavi s celicnimi specifičnimi površinskimi markerji v pomembnih frakcijah populacije mieloidnih celic, vključno z granulociti, monociti in makrofagi LysM-Cre Ctcf f / f miši (ni prikazano). Da bi ocenili, ali je brisanje alela Ctcf povzročilo pomanjkanje ekspresije Ctcf proteina, smo izvedli imunohistokemijske analize v jetrih. Kupfferjeve celice lahko prepoznamo po izražanju markerjev F4 / 80 in se od hepatocitov, ki so prisotni v jetrih, razlikujejo po manjših in bolj podolgovatih celičnih jedrih (slika 1b). Ko smo analizirali ekspresijo Ctcf, smo opazili, da Kupfferjeve celice kažejo gosto jedrsko obarvanje, medtem ko hepatociti kažejo manj intenzivno jedrsko obarvanje (slika 1c). Imunohistokemijska analiza jetrnih vzorcev miši LysM-Cre Ctcf f / f je pokazala, da so Kuffperjeve celice še vedno prisotne na očitno normalnih frekvencah. V velikem deležu Kupfferjevih celic se je izgubila ekspresija Ctcf, čeprav so bile odkrite tudi Cffcf-eksprimirajoče Kupfferjeve celice (slika 1c).

Za oceno, ali je brisanje Ctcf vplivalo na velikost makrofaga, smo uporabili pretočno citometrijo za primerjavo deležev posameznih mieloidnih subpopulacij v peritoneju in vranici. V peritonealni votlini miši LysM-Cre Ctcf f / f so bili deleži makrofagov zmerno zmanjšani, razmerja limfocitov in mieloidnega DC pa v primerjavi z nadzorom divjih vrst povečana (dodatna slika 1a). V vranici miši LysM-Cre Ctcf f / f smo opazili zmanjšano pogostost monocitov, vendar v primerjavi s kontrolo divjega tipa ni bilo pomembnih razlik v pogostosti makrofagov (dodatna slika 1b).

Čeprav je izražanje Cre, posredovano z LysM- promotorjem, povzročilo črtanje gena Ctcf v znatnem deležu makrofagov, je imel pomanjkljivost Ctcf le zmerne učinke na pogostost teh celičnih populacij v peritoneju, vranici in jetrih LysM-Cre Ctcf f / f miši.

Zmanjšana ekspresija MHC razreda II v jetrih miši LysM-Cre Ctcf f / f

Prejšnje študije so pokazale, da ima Ctcf pomembno vlogo pri regulaciji ekspresije razreda MHC v človeških B celicah. 30 Kljub pomembnemu črtanju Ctcf (slika 1) pretočne citometrične analize peritonealnih ali vranicnih makrofagov niso pokazale dokazov za zmanjšano površinsko ekspresijo MHC razreda II pri miših LysM-Cre Ctcf f / f v primerjavi z divjimi vrstami litolemov (slika 2a ). V nasprotju s tem so pretočne citometrične in histološke analize jeter miši LysM-Cre Ctcf f / f pokazale znatno zmanjšanje izražanja razreda MHC razreda II (sliki 2a in b). Kvantifikacija izražanja MHC razreda II v histoloških vzorcih jeter je pokazala zelo pomembno zmanjšanje gensko usmerjenih miši v primerjavi s kontrolnimi mišmi (slika 2c, P <0, 0001). Ker je večina celic, ki izražajo MHC razreda II, v jetrih F4 / 80 + Kupfferjeve celice, smo ocenili njihovo število in opazili, da delež celic, ki izražajo F4 / 80, ni vplival (sliki 2b in c), kar dokazuje, da je brisanje Ctcf vodi do nižjih nivojev ekspresije razreda MHC II in do izbrisa Kupfferjevih, ki izražajo MHC razred II.

Image

Delecija Ctcf povzroči nižjo ekspresijo MHC razreda II na Kupfferjevih celicah v jetrih. ( a ) Reprezentativni histogrami, ki prikazujejo ekspresijo MHC razreda II z makrofagi v perifernih organih. Sivi histogrami predstavljajo LysM-Cre Ctcf f / f, histogrami s črno črto pa makrofage divjega tipa. Skupne ne parenhimske celice iz jeter smo izolirali, kot je opisano v poglavju "Materiali in metode". Makrofagi v jetrih so bili identificirani kot CD45 + CD11c nizek, CD11b + F4 / 80 visok . Obarvanje je bilo izvedeno na vsaj petih miših divjega tipa in petih LysM-Cre Ctcf f / f miši s podobnimi rezultati. ( b ) reprezentativno imunohistokemično obarvanje za razrede MHC II in F4 / 80 na odsekih jetrnega tkiva pri divjih miših in miših LysM-Cre Ctcf f / f . Ekspresija MHC razreda II (zgornja plošča) miši LysM-Cre Ctcf f / f je bila nižja kot pri miših divjega tipa, medtem ko je bila ekspresija celic F4 / 80 + podobna (spodnja plošča). Obarvanje je reprezentativno za 9 divjih = tipov in 9 LysM-Cre Ctcf f / f miši. ( c ) Kvantitativna analiza ekspresije razreda MHC II in F4 / 80. Odseki jetrnih tkiv pri devetih miših tipa LysM-Cre Ctcf f / f in devetih mišjih divjih vrst so bili ocenjeni (1–4) za stopnjo obarvanja razreda MHC II in F4 / 80-pozitivno. Stopnja pozitivnosti na MHC razreda II, vendar ne za F4 / 80, je bila v jetrih mišk LysM-Cre Ctcf f / f znatno nižja kot pri jetrcih divjih vrst ( P <0, 0001). Ctcf, CCCTC-vezavni faktor; MHC, glavni kompleks histokompatibilnosti.

Slika v polni velikosti

Te ugotovitve kažejo, da ima Ctcf pomembno vlogo pri uravnavanju izražanja MHC razreda II v Kupfferjevih celicah, ne pa tudi pri drugih analiziranih populacijah makrofagov.

Zmanjšana in vitro diferenciacija makrofagov od LysM-Cre Ctcf f / f BM

Za proučevanje učinkov Ctcf na aktivacijo in delovanje makrofagov smo ustvarili makrofage z in vitro diferenciacijo od predhodnikov BM z uporabo pogojenega medija L-929 (slika 3a). Dobitek makrofagov CD11b + F4 / 80 + iz skupnega BM miši LysM-Cre Ctcf f / f, ustvarjenih po 7 dneh kulture, je bil znatno zmanjšan v primerjavi z miši vrste divji tip lutkarjev ( P <0, 05; Slika 3bB). Analiza izražanja mRNA Ctcf s kvantitativnim RT-PCR je pokazala znižanje na ∼ 33% divjih vrst ( n = 6), kar se je odražalo tudi z bistvenim zmanjšanjem proteina Ctcf, kot smo ga analizirali v poskusih Western blotting (dodatna slika 2). Ker smo opazili učinkovito delecijo Ctcf z izražanjem lacZ v zreli populaciji makrofagov in vivo (ni prikazano), te ugotovitve kažejo na dolgo razpolovno dobo beljakovin Ctcf ali na specifično preživetje celic, ki se izražajo s Ctcf.

Image

Delecija Ctcf poslabša in vitro razlikovanje makrofagov od celic kostnega mozga. ( a ) parcele FACS, ki opredeljujejo makrofage iz kostnega mozga kot celice CD11b + F4 / 80 + . Gojeni makrofagi iz mišk LysM-Cre Ctcf f / f izražajo podobne ravni CD11b in F4 / 80 kot makrofagi divjega tipa. Test smo izvedli s celicami devetih divjih vrst in devetih miši LysM-Cre Ctcf f / f s podobnimi rezultati. ( b ) Makrofagi so nastali in vitro, kot je opisano v materialih in postopkih, donos celic pa je bil določen na koncu kulture (7. dan). Število makrofagov, pridobljenih iz mišk LysM-Cre Ctcf f / f, je bilo znatno manjše kot pri divjih miših ( P = 0, 0235). ( c ) Reprezentativni histogrami izražanja CD86, CD40, razreda MHC II, CD206 in CD16 / 32, ki so jih gojili makrofagi divjih vrst (histogram črne črte) in miši ( LysM-Cre Ctcf f / f miši (sivi histogram), nestimulirani (zgornja vrstica) ali po stimulaciji LPS (spodnja vrstica). ( d ) Povprečna ekspresija MFI analiziranih molekul v makrofagih divjega tipa in LysM-Cre Ctcf f / f (KO) pred ali po stimulaciji z LPS. Podatki so predstavljeni kot povprečni MFI ± sem od sedmih prostoživečih mišk in 10 LysM-Cre Ctcf f / f miši. * P <0, 05, ** P <0, 01. ( e ) Sposobnost fagocitoze gojenih makrofagov smo merili tako, da smo jih preko noči inkubirali DiI-liposome. Vnos liposomov je bil količinsko opredeljen s protočno citometrijo. Podatki predstavljajo MFI ± sd iz dveh neodvisnih kultur iz vsakega genotipa. Ctcf, CCCTC-vezavni faktor; LPS, lipopolisaharid; MFI, povprečna intenzivnost fluorescence; MHC, glavni kompleks histokompatibilnosti.

Slika v polni velikosti

LysM-Cre Ctcf f / f in makrofagi divjega tipa se niso razlikovali v površinski ekspresiji linijsko povezanih markerjev F4 / 80 in CD11b (slika 3a) ali aktivacijskih markerjev CD86 in MHC razreda II (sliki 3c in d). Na LysM-Cre Ctcf f / f smo opazili nižjo ekspresijo CD206 in CD16 / 32 kot na makrofagih divjega tipa, vendar te razlike niso bile statistično pomembne. Vendar pa je bila površinska ekspresija CD40 bistveno zmanjšana na makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f v primerjavi z makrofagi divjega tipa, nestimulirani in po stimulaciji LPS (sliki 3c in d).

Ugotovili smo, da imajo makrofagi, pridobljeni z BM, iz mišk LysM-Cre Ctcf f / f in miši divjega tipa, podobno sposobnost kot fagocitozni DiI-označeni liposomi (slika 3e). Končno je bila sposobnost preživetja LysM-Cre Ctcf f / f in makrofagov divjega tipa podobna, tako z in brez stimulacije LPS (ni prikazana).

Zato je bila odsotnost Ctcf povezana z zmanjšano in vitro diferenciacijo makrofagov, ki izvirajo iz BM, tako v številu celic kot glede površinske ekspresije CD40.

Makrofagi LysM-Cre Ctcf f / f kažejo zmanjšano TLR-inducirano proizvodnjo IL-10 in TNF

Nato smo analizirali sposobnost makrofagov LysM-Cre Ctcf f / f, da proizvajajo citokine ob indukciji različnih agonistov TLR. Po stimulaciji z LPS in R848 makrofagi LysM-Cre Ctcf f / f proizvajajo nižje ravni IL-10 kot makrofagi divjega tipa ( P <0, 05), medtem ko pri stimulaciji CpG razlike v proizvodnji IL-10 niso bile pomembne (slika 4 ). Stimulacija z vsemi tremi različnimi agonisti TLR je pokazala znatno zmanjšanje proizvodnje TNF z makrofagi iz miši LysM-Cre Ctcf f / f v primerjavi s kontrolami ( P <0, 05). V nasprotju s tem je bila proizvodnja IL-12p40 ali IL-6 s strani LysM-Cre Ctcf f / f ali divjih makrofagov podobna po TLR ligaciji (slika 4).

Image

Motena indukcija citokinov s pomočjo makrofagov iz kostnega mozga iz mišjih LysM-Cre Ctcf f / f na ligacijo TLR4, TLR7 / 8 in TLR9. 1 × 10 5 makrofagov iz kostnega mozga iz divjih vrst in miši LysM-Cre Ctcf f / f smo stimulirali z LPS, R848 in CpG 24 ur. Nivo IL-10, TNF, IL-12p40 in IL-6 v supernatantu smo izmerili z ELISA. Podatki kažejo koncentracije proizvedenih citokinov (pg / ml). Poskusi so bili izvedeni z uporabo neodvisnih kultur devetih miši divjega tipa in devetih miši LysM-Cre Ctcf f / f . Ctcf, CCCTC-vezavni faktor; IL, interlevkin; LPS, lipopolisaharid; MHC, glavni kompleks histokompatibilnosti; TLR, cestninski receptor; TNF: dejavnik tumorske nekroze

Slika v polni velikosti

Družina citokinov IL-10 vključuje IL-19, IL-20 in IL-24. Vsi geni, ki kodirajo te citokine, so locirani v grozdu skupaj z genom IL-10 na kromosomu 1q31-32 31, 32 (slika 5a). Vzporedno s TH2 citokinskim lokusom 19 smo postavili hipotezo, da lahko tudi IL-10 lokus vsebuje več Ctcf mest, kar bi omogočilo medsebojno delovanje kromatina med regulacijskimi elementi in promocijskimi regijami za posamezne gene citokinov. Ker so mesta, ki vežejo Ctcf, običajno značilna za različne tipe celic, smo 33, 34 uporabili naš poročani nabor mest, ki vežejo Ctcf, identificirane v gojenih primarnih celicah pred B s kromatinsko imunoprecipitacijo, povezano s sekvenciranjem z visoko hitrostjo (ChIP-Seq) . 22 Ugotovili smo, da lokus IL-10 vsebuje več vezivnih mest Ctcf, ki se ne nahajajo v promocijskih regijah posameznih genov citokinov, temveč med citokinskimi geni (slika 5a). To bi bilo skladno z vlogo Ctcf pri zankovanju in omogočanju medsebojnih interakcij DNK, ki so bistvenega pomena za usklajeno izražanje posameznih genov v IL-10 lokusu.

Image

Oslabljena TLR-povzročena ekspresija mRNA družinskih članov IL-10 v makrofagih, ki izvirajo iz kostnega mozga, pri miših LysM-Cre Ctcf f / f . ( a ) Mišje genomsko območje, ki vsebuje lokus družine genov IL-10. Podatki Ctcf ChIP-Seq so prikazani nad lokalizacijo družine IL-10 (IL-10, IL-19, IL-20 in IL-24) in stranskih genov. Podatki ChIP-Seq so bili pridobljeni iz gojenih celic pred B. 21, 22 kb = kilobaz. ( b ) Makrofagi, pridobljeni iz kostnega mozga, iz divjih vrst in miši LysM-Cre Ctcf f / f smo stimulirali 5 ur z LPS, R848 ali CpG. Ekspresijo mRNA IL-10, IL-19, IL-20 in IL-24 v makrofagih smo količinsko opredelili s PCR v realnem času in izrazili glede na GAPDH. Vrednosti, prikazane, prikazujejo 3–5 miši na poskusno skupino. Statistična analiza: parni t- test, * P <0, 05. ChIP-Seq, kromatinsko imunsko-oborjevanje, povezano z zaporedjem visokega pretoka; Ctcf, CCCTC-vezavni faktor; IL, interlevkin; LPS, lipopolisaharid; TLR, cestninski receptor.

Slika v polni velikosti

Zato smo se odločili, ali bomo poleg proizvodnje proteina IL-10 zmanjšali tudi nivoje transkripcije genov Il10 in tesno povezane gene Il19 , Il20 in Il24 v makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f po TLR ligaciji. V skladu z opazovanjem na ravni beljakovin je bila ekspresija IL-10 mRNA zmanjšana v makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f , zlasti ob stimulaciji R848 ( P <0, 05; Slika 5b). Zanimivo je, da makrofagi LysM-Cre Ctcf f / f kažejo nižjo ekspresijo tudi drugih treh IL-10 lokus citokinov, pri čemer je bil dosežen pomen za IL-19 ob stimulaciji R848 ( P <0, 05) in za IL-20 pri LPS ali CpG stimulacija ( P <0, 05; Slika 5b). Opažene zmanjšane tvorbe citokinov v makrofagih, ki so pomanjkljivi za Ctcf, ni mogoče preprosto razložiti z učinkom Ctcf na ekspresijo TLR, saj makrofagi, ki izhajajo iz LysM-Cre Ctcf f / f BM, niso pokazali zmanjšane ravni mRNA Tlr4, Tlr8 ali Tlr9 (dodatna slika 3).

Skupaj ti podatki kažejo, da odsotnost Ctcf v makrofagih ne vpliva na njihovo sposobnost proizvajanja IL-6 ali IL-12, ampak je povezana z zmanjšano izražanjem citokinov TNF-α in IL-10 ob stimulaciji z različnimi TLR ligandi.

Profiliranje izražanja genov v makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f, pridobljenih iz BM, po stimulaciji LPS

Nazadnje smo želeli raziskati učinek črtanja Ctcf v makrofagih na način, ki zajema vse gene . V ta namen smo izvedli profiliranje genov LysM-Cre Ctcf f / f in makrofagov divjega tipa ob čezmerni stimulaciji LPS. Od 23 500 odkritih genov je bilo 617 genov (212 navzgor in 405 navzdol) različno izraženih med LysM-Cre Ctcf f / f in makrofagi divjega tipa (prag dvojnega). 100 najbolj znižanih in 100 najbolj reguliranih genov je prikazano v tabeli 1. Kot je bilo pričakovano, je bil Ctcf med temi najbolj znižalnimi geni. Analizirali smo izražanje genov, ki so bili v makrofagih s pomanjkanjem Ctcf uprli v primerjavi z makrofagi divjega tipa. Ti reducirani geni so vključevali CCL8 in CCL12 (znana tudi kot monocitni hemotaktični protein-2 in monocitni hemotaktični protein-5 in Cxcl10 (znan tudi kot IP-10), ki sta hemotaktična in aktivirata številne imunske celice, kot so monociti, T celice in Poleg tega so bili geni, vključeni v antibakterijske (Nos2) ali protivirusne odzive (Mx1, Mx2, ISG20 in Rsad2), močno znižani, kar kaže na šibkejše odzive na odstranjevanje patogenov. Poleg tega smo opazili zmanjšano izražanje molekul, za katere je znano, da negativno uravnavajo imunost., vključno z IL1rn, cd274 (PD-1 ligand) in fgl-2 (fibrinogenom podoben protein 2), ki imajo lahko enako funkcionalno posledico kot nižje ravni imunosupresivnega citokina IL-10, kot smo ga opazili po stimulaciji z LPS ali R848 Odkrili smo tudi zmanjšano izražanje sintetaze dušikovega oksida Nos2, ki katalizira proizvodnjo dušikovega oksida in prispeva k protimikrobni ali protitumorski funkciji makrofagov kot dela o oksidativni razpok.

Tabela polne velikosti

Številni geni, ki so bili makrofagi s pomanjkanjem Ctcf občutno uregulirani, vključno z mejotskimi jedrskimi razdelki 1 homolog (Mnd1, ∼ 14 ×), antigenom CD69 (∼ 13 ×) in integralnim membranskim proteinom 2a (Itm2a, ∼ 9 ×), so bili prej je bilo ugotovljeno, da jih Ctcf nadzira v celicah predhodnika B (Mnd1, CD69, Itm2a) 22 ali med razvojem okončin sesalcev (Mnd1, Itm2a) 35 in lahko odraža neposredne cilje Ctcf, neodvisne od celične linije. Pričakuje se, da bodo drugi geni s Ctcf bolj posredno regulirali, na primer olajševalec prenosa sladkorja Slc2a3 (.5 11, 5 ×), morda prek navzkrižne povezave med vtisnjenim rastnim povpraševalnim genom Igf2, nadzorovanim s Ctcf . 36 Med geni, ki so bili urejeni v makrofagih, ki niso imeli Ctcf, so bili tudi geni z bolj značilno funkcijo za makrofage, vključno z encimom 5-lipoksigenazo (Alox5, 7 ×), ki sodeluje pri tvorbi levkotrienov, ki krepijo fagocitozo in NADPH oksidazo Nox1 ( × 5 ×), pomemben vir reaktivnih kisikovih vrst v makrofagih. Poleg tega so makrofagi s pomanjkanjem Ctcf izrazili, na primer, višjo raven hemokinskega receptorja CX3CR1 (∼ 3 ×), za katerega je znano, da uravnava črevesno makrofago homeostazo 37 in fosfodiesterazo Pde2a (∼ 3 ×), ki se sproži med stimulacijo kolonije makrofagov faktorska diferenciacija makrofagov. 38

DISKUSIJA

Ctcf je bil prepoznan kot pomemben regulator medsebojnih kromatinskih interakcij v limfocitih4, vendar vloga Ctcf v celicah makrofagov ni bila raziskana. Makrofagi so ključne celice pri imunskih odzivih na bakterije in viruse ter za odstranjevanje apoptotičnih celic ali celičnih naplavin. Sprožitev makrofagov s široko paleto receptorjev za prepoznavanje vzorcev je začetni korak, kar hitro privede do prevzema patogena in naplavin ter sproščanja molekul efektorjev, kot so citokini. Ta študija prvič opisuje učinek specifične delecije Ctcf v makrofagih pri miših. In vivo je brisanje Ctcf povzročilo blag fenotip. Poleg tega je bila v jetrih miši LysM-Cre Ctcf f / f in v manjši meri v vranici močno zmanjšana ekspresija razreda MHC II. Končno so makrofagi, ustvarjeni in vitro iz BM miši LysM-Cre Ctcf f / f, pokazali normalen fenotip, vendar so znatno zmanjšali sposobnost indukcije ekspresije družinskih genov IL-10 in proizvodnjo IL-10 in TNF po stimulaciji z različni TLR ligandi, medtem ko ravni IL-12p40 in IL-6 niso vplivale.

O pomenu Ctcf pri nadzorovanju izražanja razreda MHC II so že poročali. 30, 39 V skladu s tem smo ugotovili specifično zmanjšanje izražanja MHC razreda II na Kupfferjevih celicah v jetrih pri miših LysM-Cre Ctcf f / f . Ker na število Kupfferjevih celic v jetrih ni vplivalo, naše ugotovitve potrjujejo predhodno ugotovljeno sodelovanje Ctcf v izražanju genov v lokusu MHC. Nismo pa opazili spremembe izraza MHC razreda II v slezenozni, peritonealni ali v gojenih makrofagih. Zanimivo je, da so bili trije geni, ki se nahajajo v lokusu MHC ( Cfb , Daxx in Tap2 ), v makrofagih, stimuliranih z LPSM, stimulirali LysM-Cre Ctcf f / f glede na divji tip (razmerje: 0, 49, 0, 43 in 0, 49), kar kaže na odsotnost modulacija ekspresije razreda MHC lahko odraža pomanjkljive medsebojne interakcije na območju MHC v odsotnosti Ctcf v Kuppferjevih celicah pri miših. Poleg tega lahko različne stopnje izražanja LysM v različnih tkivih povzročijo tudi razlike v opazovanem fenotipu. Zmanjšanje števila peritonealnih in gojenih makrofagov, kot smo jih opazili pri miših LysM-Cre Ctcf f / f, je lahko rezultat uregulacije proto-onkogena c-Myc v primerjavi s kontrolo, kot smo opazili v naši analizi mikroraščanja (∼ 3, 6 ×; dopolnilo Tabela 1), kar je tudi v skladu s predhodno poročanimi ugotovitvami. 40 Prekomerna ekspresija c-Myc lahko povzroči povečano proliferacijo, lahko pa tudi apoptozo. Poleg c-Myc so bili v makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f različni ekspresionirani geni pomembno zastopani v celičnem ciklu, celični smrti in razmnoževanju ter lahko posledično modulirajo število makrofagov. Mieloidne celice znižujejo ekspresijo Ctcf med zorenjem 41 in prekomerno izražanje Ctcf pri mieloidnih potomcih, kar je povzročilo močno oslabljen razvoj in preživetje DC, 17 kar kaže, da je za kompetentni razvoj mieloidnih celic lahko pomembna natančna regulacija izražanja Ctcf.

Nabor genov, ki se je med diferenciacijo makrofagov znižal, vendar jih je spodbudila TLR stimulacija, so geni Schlafen (Slfn), zlasti Slfn4. 42 V našem naboru podatkov so bile stopnje ekspresije genov Slfn1 , Slfn4 in Slfn9 po stimulaciji LPS v LysM-Cre Ctcf f / f nižje kot pri kontrolnih makrofagih (razmerje: 0, 21, 0, 38 in 0, 38). Ker smo pokazali, da izbris Ctcf ne vpliva bistveno na nivo ekspresije TLR4, TLR8 in TLR9 mRNA in ker ti geni niso neposredna tarča Ctcf, je bil opaženi učinek lahko posredno povzročen s IFN tipa I. 42 Regulacija izražanja TNF s strani Ctcf je v skladu z literaturo. 43 Poleg tega smo pokazali zmanjšano proizvodnjo IL-10 v makrofagih kot posledica izčrpavanja Ctcf, podobno kot nizka proizvodnja IL-10 po deleciji Ctcf v celicah Th2, kot smo prej opazili. 19 V makrofagih stimulacija TLR4 povzroča proizvodnjo IL-10 s pomočjo TRAF3 in NF-κB 26, 44 in - resnično - smo ugotovili znižanje genov nizvodno od kompleksa NF-κB v makrofagih LysM-Cre Ctcf f / f . Ugotovili smo, da gen IL-10 skriva Ctcf-vezavna mesta na 5 'in 3' koncu v celicah pred B. Ti podatki kažejo, da so mesta za vezavo Ctcf prisotna v kompleksnem IL-10 citokinskem lokusu, čeprav ni jasno, ali se Ctcf na makrofag veže na ta lokus. Kljub temu, da so mesta Ctcf relativno različna v različnih tipih celic in ker ima Ctcf bistveno vlogo v kromatinski arhitekturi, je mogoče razumeti možni pomen Ctcf pri reorganizaciji lokusa IL-10, ki se pojavi pri stimulaciji TLR. 45 V skladu s tem naši podatki kažejo, da zmanjšano izražanje Ctcf v makrofagih modulira ekspresijo IL-10 homologov IL-19, IL-20 in IL-24, ki se izražajo v zelo ohranjenem grozdu citokinov. Naše ugotovitve identificirajo Ctcf kot pomemben regulator genskih lokusov družine IL-10.

V tej raziskavi prikazujemo, da je delecija Ctcf v celicah z aktivnim LysM v miših povzročila blag upad števila nevtrofilcev, monocitov in makrofagov v nekaterih perifernih tkivih. Naše opazovanje, da so bile razlike v ekspresiji genov bolj izrazite v kulturah makrofagov z nižjimi vrednostmi mRNA Ctcf, podpira mnenje, da je blag fenotip, opažen in vivo, lahko posledica ostanka proteina Ctcf. Ni jasno, kaj lahko povzroči morebitno zadrževanje proteina Ctcf v mieloidnih celicah. Izražanje lacZ poročevalca je pokazalo specifično delecijo Ctcf v mieloidnih celicah, vendar to ne izključuje možnosti, da bi v nekaterih celicah lahko prišlo do nepopolnih delecij Ctcf na obeh alelih. Literatura, ki prikazuje popolno brisanje floxed transgenov po sistemu LysM-Cre 23, 46, skupaj z našimi podatki, ki kažejo zmanjšanje ekspresije Ctcf do 25% divjega tipa, ne podpira tega pojma. Raje predvidevamo, da lahko zaradi hitrega pretoka mieloidnih celic v miših, ki vodi kratek čas med dogodkom brisanja in analizo v kombinaciji z dolgo razpolovno dobo beljakovine Ctcf v celicah, podkrepijo opažene razlike v preostali ravni Ctcf proteina.

Makrofagi miši LysM-Cre Ctcf f / f so pokazali normalno sposobnost fagocitoze in produkcijo vnetnih citokinov IL-12 in IL-6, vendar je zmanjšala proizvodnjo citokinov TNF in IL-10, kar kaže na omejeno spremembo funkcionalnosti kot posledica izbris Ctcf. Naša analiza Ctcf ChIP-seq je pokazala dokaz za močno vezavo Ctcf v območju k 10 kb, ki obsega Tnf , Lta (limfotoksin-α) in Ltb gene, pa tudi v lokusih, ki kodirata IL-6 in IL-12p40 (RWH, neobjavljeno) . Nadaljnji poskusi so potrebni za raziskovanje, če Ctcf deluje kot neposredni regulator lokusa Tnf-Lta-Ltb ali zakaj ni videti, da Ctcf uravnava ekspresijo genov Il6 ali Il12b . Posledice teh ugotovitev so lahko pomembne v patoloških pogojih, da vplivajo na proizvodnjo citokinov, ne da bi vplivali na druge funkcije makrofagov. Regulacija IL-10 ali TNF, ki jo proizvajajo makrofagi, bi lahko izboljšala imunoterapijo tumorjev z zmanjšanjem neželene proizvodnje IL-10 in indukcijo imunosupresivnih makrofagov. 47, 48 Prav tako bi lahko nadzorovana indukcija IL-10 ali TNF pri sladkorni bolezni izboljšala celjenje ran ali uravnavanje avtoimunskega odziva. 49, 50

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dodatne informacije spremljajo prispevek na spletnem mestu Cellular & Molecular Immunology .