Dapper1 spodbuja avtofagijo z izboljšanjem tvorbe kompleksa beclin1-vps34-atg14l | celične raziskave

Dapper1 spodbuja avtofagijo z izboljšanjem tvorbe kompleksa beclin1-vps34-atg14l | celične raziskave

Anonim

Predmeti

  • Avtofagosomi
  • Avtofagija
  • Celična signalizacija
  • Nevrodegenerativne bolezni

Izvleček

Avtofagija je postopek znotrajcelične razgradnje za čiščenje agregiranih beljakovin ali starih in poškodovanih organelov. Kompleks Beclin1-Vps34-Atg14L je bistvenega pomena za tvorbo avtofagosomov. Kako pa je urejena tvorba kompleksa, ni jasno. Tukaj prikazujemo, da Dapper1 (Dpr1) deluje kot kritični regulator kompleksa Beclin1-Vps34-Atg14L za spodbujanje avtofagije. Ablacija Dpr1 v centralnem živčnem sistemu povzroči motnjo motorične koordinacije in kopičenje p62 in vseprisotnih proteinov. Dpr1 poveča tvorbo avtofagosomov, kar kažejo povišane tvorbe punkta LC3, Atg14L in DFCP1 (dvojno beljakovino 1, ki vsebuje FYVE). Nasprotno pa izguba Dpr1 poslabša likvidnost LC3 in povzroči kopičenje p62 / SQSTM1. Dpr1 neposredno sodeluje z Beclin1 in Atg14L ter izboljšuje Beclin1-Vps34 interakcijo in Vps34 aktivnost. Naši izsledki kažejo, da Dpr1 povečuje tvorbo kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34, da bi poganjal avtofagijo.

Uvod

Makroavtofagija, v nadaljnjem besedilu avtofagija, je reguliran postopek samostojnega prehranjevanja, ki izloča celične materiale, kot so združeni citoplazemski proteini ali starani in poškodovani organeli z razpadom lizosoma kot odgovor na stradanje in drug metabolični stres 1, 2, 3, 4, 5 . Čeprav se avtofagija ponavadi pojavlja kot neselektivni odziv na stradanje in drug stres, se ta postopek dogaja tudi pod pogojem, bogat s hranili (imenovanim bazalna avtofagija ali konstitutivna avtofagija), ki preprečuje kopičenje beljakovin, povezanih z boleznijo, in ima poseben pomen pri boleznih nevrodegeneracije 6, 7, 8, 9 . V avtofagijo in z njo povezano pot 5, 10 je vključenih več kot 30 genov ATG, identificiranih z gensko analizo kvasovk. Številni jedrni ATG proteini, kot so kompleks Beclin1-Vps34-Atg14L, kompleks Atg5-Atg12-Atg16 in homogumi Atg8, so potrebni za tvorbo avtofagosomov tako pri avtohtonosti, ki jih povzroča lakota, kot bazalna 11 .

Med jedrnimi ATG geni Beclin1 , ortolog Atg6 , kodira zvite proteine, ki se vežejo na fosfatidilinozitol-3-kinazo razreda III Vps34, ki ustvarja fosfatidilinozitol-3-fosfat (PtdIns (3) P), potreben za tvorbo avtofagosomov 12 . Z Beclin1, Vps34 in Vps15 kot skupnimi komponentami so bili identificirani trije različni kompleksi Beclin1-Vps34: eden vsebuje Beclin1, Vps34, Vps15 in Atg14L; ena vsebuje Beclin1, Vps34, Vps15 in UVRAG; in drugo, ki vsebuje Beclin1, Vps34, Vps15, UVRAG in Rubicon 13, 14, 15, 16. Kompleks Atg14L deluje pri tvorbi avtofagosomov, kompleks UVRAG deluje pri zorenju avtofagosomov in endosomov, medtem ko naj bi kompleks Rubicon zaviral zorenje avtofagosomov in endosomov.

Bazalna avtofagija igra bistveno vlogo pri vzdrževanju homeostaze tkiv. Nevronski specifični knockout ATG genov, kot so Atg5 , Atg7 in FIP200 pri miših, vse bistvene sestavine avtofagije sesalcev, je privedel do nenormalnega kopičenja vseprisotnih beljakovin in nevrodegeneracije 6, 7, 17 . Te miši, ki so pomanjkljive za avtofagijo, so se rodile normalno, vendar so se razvile progresivne vedenjske pomanjkljivosti, kot so stiskanje okončin, tremor in ataksičen vzorec hoje. Patološke spremembe, ki jih je bilo mogoče opaziti med 6. in 8. tednom, so vključevale množično smrt Purkinjevih celic, povečano apoptozo in nabiranje vseprisotnih agregatov, kar je podobno znaku nevrodegeneracijskih bolezni.

Pokazalo se je, da Dapper1 / Dact1 (Dpr1), ki je bil prvotno identificiran kot razbeljen (Dvl) beljakovin, ki je v interakciji z dvema hibridoma kvasa 18, zavira konicne in nekanonične Wnt poti, ki jih posreduje Dvl, s spodbujanjem razgradnje Dvl skozi lizosome 19, 20 . Mi in drugi smo poročali, da je ablacija Dpr1 pri miših povzročila hude malformacije posterior, kar je povzročilo smrt na poporodni dan 1 19, 21 . Da bi preučili funkcijo Dpr1 v tkivih odraslih miši, smo v tej raziskavi ustvarili pogojne miške Dpr1- knockout in ugotovili, da izguba gena Dpr1 v centralnem živčnem sistemu povzroči nevrodegenerativno motnjo, ki spominja na miši, ki imajo pomanjkanje avtofagije. Nadalje smo pokazali neznano funkcijo Dpr1, ki deluje kot pozitiven regulator za pospeševanje tvorbe kompleksa Beclin1-Vps34-Atg14L in izboljšanje avtofagije.

Rezultati

Ablacija Dpr1 v centralnem živčnem sistemu povzroči motnje motorične koordinacije in nevronske motnje

Ablacija gena Dpr1 pri miših je povzročila številne urogenitalne okvare, kar je vodilo v smrt novorojenčkov v enem dnevu po rojstvu 19, 21 . Da bi nadalje obravnavali fiziološko funkcijo Dpr1 v tkivih odraslih miši, smo ustvarili Dpr1 pogojni knockout miši ( Dpr1 fl / fl ) in ga križali s transgeničnimi miši, ki izražajo Cre rekombinazo pod nadzorom Nestinskega promotorja ( Nestin-Cre ), da ustvari Dpr1 -uškodovane miši v osrednjem živčevju. Brisanje eksona 2 in 3 s kreiranjem je povzročilo mutacijo okvirja in s tem odpravilo izražanje gena Dpr1 v možganskih tkivih (dodatne informacije, slika S1A-S1B). Miše so bile po videzu živalskega tipa živahne in jih ni mogoče razlikovati. Vendar so 3-mesečne miške Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre mišem pri preizkusu rotarod začele kazati motnje motorične koordinacije in so pri 12 mesecih dosegle nenormalne reflekse udov (slika 1A-1B in dodatne informacije, film S1), ki je pogosto povezana z nevrodegenerativnimi boleznimi 22 . Ker ima možganov pomembno vlogo pri motoričnem nadzoru, smo nadalje preučili, ali je ablacija Dpr1 povzročila kakšne patološke spremembe v možganu . Obarvanje z imunofluorescenco je pokazalo, da se je število Purkinjevih celic, obarvanih s kalbindinom, v Dprl fl / fl ; mišicam Nestin-Cre se je zmanjšalo v možganu skupaj s kopičenjem p62 (slika 1C in dodatne informacije, slika S1C). Raven GFAP, markerja za glijalne celice, je bila močno povišana v možganski skorji, možganski skorji in zrnate celične plasti Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre v primerjavi s kontrolo (slika 1D-1E), kar kaže na prisotnost poškodb nevronov v teh regijah. Da bi ugotovili, ali je zmanjšano število nevronov pri miših mutiranih povzročilo celično smrt, smo izvedli test TUNEL in ugotovili, da so apoptotične celice res povečane v Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre mišji možgan (Slika 1F). Ti rezultati kažejo, da ablacija Dpr1 vodi v nevronsko motnjo, ki je podobna fenotipom, ki so jih opazili pri avtofagični okvari Atg5 fl / fl ; Nestin-Cre in Atg7 fl / fl ; Nestin-Cre miši 6, 7 .

Image

Ablacija Dpr1 privede do okvare motorične koordinacije in nevronskih nepravilnosti pri miših Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre miši. (A) Motena motorična koordinacija 5-mesečnih Dprl fl / fl ; miši Nestin-Cre, prikazane z rotarodnim testom. Miške Dpr1 + / + ; Nestin-Cre ( n = 5) in Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre ( n = 5) smo postavili na palico, ki se vrti pri 40 vrt./min., In čas, porabljen na palici. *** P <0, 001. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (B) Nenormalno stiskanje okončin 12-mesečnega Dpr1 fl / fl ; miška Nestin -Cre v primerjavi z mišjo Dpr1 + / + ; Nestin-Cre miško, ko jo dvignemo za rep. (C) Zmanjšane Purkinje-pozitivne celice na kalbindin v možganu 7-mesečnih Dprl fl / fl ; miši Nestin-Cre . Purkinjeve celice smo količinsko opredelili ( n = 3). Tehtnice, 100 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (D) Povišane GFAP-pozitivne glialne celice v možganu 7-mesečnih Dprl fl / fl ; miši Nestin-Cre . Desne plošče: povečave. Število GFAP-pozitivnih celic je bilo količinsko določeno ( n = 3). Tehtnice, 100 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (E) Imunofluorescentno slikanje povišanih GFAP-pozitivnih glialnih celic v možganski skorji 12-mesečnih Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre . Odstotek GFAP-pozitivnih celic je bil količinsko opredeljen in izračunan z normalizacijo števila celic, pozitivnih na GFAP, na število celic, obarvanih z DAPI ( n = 3). Tehtnice, 200 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (F) TUNEL obarvanje cerebeluma 9-mesečne Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre miši. Apoptotične celice smo količinsko opredelili ( n = 3). Tehtnice, 100 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD.

Slika v polni velikosti

Izguba Dpr1 poslabša bazalno avtofagijo v centralnem živčnem sistemu in jetrnih tkivih

Za nadaljnjo potrditev, ali izguba Dpr1 in vivo poslabša avtofagijo, smo z imunohistologijo preučili ravni vseprisotnih proteinov in p62 v telesu s celičnim vključevanjem. Kot je prikazano na sliki 2A, so bili vseprisotni proteini močno povišani v možganu , možganski skorji in hipokampusu Dprl fl / fl ; miši Nestin-Cre v primerjavi s kontrolo. Podobno se je povečal p62 tudi v možganu in možganski skorji pri 7-mesečnih mutiranih miših (slika 2B). Povišane ravni p62 in vseprisotnih proteinov so bile potrjene tudi z imunoblotiranjem pri 9-mesečnih mutiranih miših (slika 2C). Vseprisotni proteini in p62 puncta so bili prav tako povišani in kolokalizirani v celični plasti Purkinje, ponsu in meduli 12-mesečne Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre (slika 2D). Ti rezultati močno kažejo, da pomanjkanje Dpr1 poslabša bazalno avtofagijo v centralnem živčnem sistemu.

Image

Izbris Dpr1 poslabša bazalno avtofagijo v centralnem živčnem sistemu in jetrnih tkivih. (A) Povišane ubikvitin pozitivne celice v možganu, možganski skorji in hipokampusu pri 7-mesečnih Dpr1 fl / fl ; miših Nestin-Cre . Tehtnice, 250 μm. Desne plošče vsake skupine: povečave. (B) povišane p62-pozitivne celice v možganu in možganski skorji 7-mesečnih Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre . Tehtnice, 250 μm. Desne plošče vsake skupine: povečave. (C) Imunobloting analiza ubikvitina in p62 v možganski skorji Dprl + / + ; Nestin-Cre in Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre . Tubulin je bil uporabljen kot nadzor obremenitve. Količine ubikvitina in p62 so bile količinsko opredeljene in normalizirane glede na tubulin. (D) Imunofluorescentno slikanje povišanih celic ubikvitin-p62 v celicah Purkinje, ponsov in medul 12-mesečnih starih Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre . Število ubikvitin-p62 puncta je bilo količinsko določeno ( n = 3). Tehtnice, 20 μm. * P <0, 05. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (E) Znižane ravni LC3-II v primarnih gojenih hepatocitih od 4-mesečne Dpr1 fl / fl ; Alb-Cre miši z ali brez 100 nM BafA1 4 ure. Količino LC3-II smo količinsko opredelili in normalizirali glede na tubulin. (F) Kopičenje beljakovin Dvl2 in p62 v jetrih Dpr1 - / - iz običajnih miši iz Dpr1 na poporodni dan 1. Dvl2 smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Količino Dvl2 in p62 smo količinsko določili in normalizirali glede na tubulin.

Slika v polni velikosti

Nadalje smo preučili avtofagično aktivnost Dpr1 v mišjih jetrih, kjer tudi avtofagija igra ključno vlogo pri homeostazi jeter 8 . Opazili smo znižano raven LC3-II v primarnih gojenih hepatocitih iz Dprl fl / fl ; Alb-Cre miši (slika 2E). Za zaznavanje aktivnosti avtofagije in vivo smo ustvarili miši Dprl - / - ; GFP-LC3 iz mišk Dprl +/− 19 in transgenih miši 23 GFP-LC3 23 . V pogojih hranjenja na prvi poporodni dan so bili v jetrih Dpr1 +/− odkriti punkta GFP-LC3, vendar je bil v jetrih Dpr1 - / - znatno zmanjšan (dopolnilne informacije, slika S2A). V nasprotju z jetri Dpr1 + / + ali Dpr1 +/−, so Dpr1 - / - jetrci novorojenih miši pokazali izrazito povečano raven proteinov p62 in Dvl2 (slika 2F). Vseprisotni proteini so bili znatno povišani tudi v jetrih Dpr1 - / - (dopolnilne informacije, slika S2B). Odstranjevanje Dpr1, specifično za jetra, je povzročilo tudi povišano raven glikogena (dopolnilne informacije, slika S2C), kar kaže na disfunkcijo jeter 24 . Ti rezultati kažejo, da pomanjkanje Dpr1 vodi v zmanjšano avtofagijo v jetrih.

Dpr1 spodbuja avtofagijo

Zgornji podatki kažejo, da ima Dpr1 pozitivno vlogo pri avtofagiji. Da bi to potrdili, smo analizirali avtofagično aktivnost mišjih embrionalnih fibroblastov Dpr1 - / - (MEF) iz mišk E13.5 Dpr1 - / - . V nasprotju z MEF- jem divjega tipa se je pretvorba LC3-II, indikator za avtofagično aktivnost, močno zmanjšala pri Dpr1 - / - MEF v prisotnosti ali odsotnosti lizosomskega zaviralca Bafilomicin A1 (BafA1) (slika 3A) in podobno rezultat smo dobili pri stanju Hank-ove uravnotežene solne raztopine (HBSS), ki je povzročil stradanje (slika 3B). Ti podatki kažejo, da se avtofagijski tok zmanjša, če Dpr1 ni. V skladu s tem je nastajanje LC3 puncta, označevalca za avtofagosome 25, oslabljeno pri Dprl - / - MEF, zlasti kadar je bil BafA1 uporabljen za blokiranje aktivnosti lizosomov (slika 3C). V Dpr1 - / - MEF-u na slabitev lipidiranja LC3 ni vplival signalizator Wnt signalizacije XAV939 26 (dopolnilne informacije, slika S3A), kar kaže, da Dpr1 spodbuja avtofagijo, neodvisno od njene vloge pri motenju signalizacije Wnt. Izpad Dpr1 je privedel do večje tvorbe punkta p62 v Dpr1 - / - MEF v pogojih, bogatih s hranili (slika 3D). V skladu s tem, da v odsotnosti BafA1 se je nabiral p62 v Dprl - / - MEF (slika 3E), medtem ko je ektopično izražen Dpr1 zmanjšal raven beljakovin p62 v celicah HEK293T (slika 3F). Dpr1 ni imel očitnega učinka na ekspresijo p62 mRNA (dopolnilne informacije, slika S3B). Ker lahko p62 služi kot pokazatelj avtofagične aktivnosti 9, 25, ti podatki kažejo, da Dpr1 spodbuja avtofagijo, da pospeši promet p62. Poleg tega je prekomerna ekspresija Dpr1 znatno povečala raven LC3-II (slika 3G) in nastanek avtofagosomov v pogojih, bogatih s hranili (slika 3H). Izguba Dpr1 je tudi zmanjšala razgradnjo dolgoživih beljakovin v pogojih, bogatih s hranili in stradanjem (Slika 3I). Ti rezultati skupaj dokazujejo, da Dpr1 pospešuje bazalno in stradanje avtofagijo.

Image

Dpr1 spodbuja avtofagijo. (A) Imunobloting analiza LC3 II / I v Dpr1 + / + in Dprl - / - MEF v prisotnosti ali odsotnosti 100 nM BafA1 4 ure. Količino LC3-II smo količinsko opredelili in normalizirali glede na tubulin. (B) Imunobloting analiza LC3 II / I v Dpr1 + / + in Dpr1 - / - MEF po zdravljenju z ali brez HBSS gojišča 4 ure. Količino LC3-II smo količinsko opredelili in normalizirali glede na tubulin. (C) Reprezentativne konfokalne slike endogene porazdelitve LC3 v Dpr1 + / + in Dpr1 - / - MEF v prisotnosti ali odsotnosti 100 nM BafA1. Točno število LC3 je bilo količinsko določeno ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. * P <0, 05; ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (D) Reprezentativne konfokalne slike porazdelitve p62 v Dpr1 + / + in Dpr1 - / - MEF v pogojih, bogatih s hranili. Točno število p62 je bilo količinsko opredeljeno ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (E) beljakovine p62 se je nabralo v Dpr1 - / - MEF v primerjavi z Dpr1 + / + MEF v odsotnosti 100 nM BafA1. Za nadzor obremenitve je bil uporabljen β-aktin. Količino p62 smo količinsko opredelili in normalizirali glede na β-aktin. (F) Prekomerna ekspresija Dpr1 je znižala raven beljakovin p62 brez 100 nM BafA1 zdravljenja v celicah HEK293T. Za nadzor obremenitve je bil uporabljen β-aktin. Količino p62 smo količinsko opredelili in normalizirali glede na β-aktin. (G) Povišana tvorba LC3-II v celicah HEK293T, ki izražajo Myc-Dpr1 po obdelavi s 100 nM BafA1 4 ure. Količino LC3-II smo količinsko opredelili in normalizirali glede na tubulin. (H) Elektronske mikrografije avtofagosomov ali avtolizosomov, ki jih povzroči ekspresija Dpr1 v celicah HEK293T. Tehtnice, 500 nm. Spodnje plošče: povečave. Bele puščice označujejo avtofagosome, črne puščice pa avtolizosome. Število avtofagosomov in avtolizosomov je bilo količinsko določeno ( n = 3). ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (I) Razgradnja 3 H-označenih dolgoživih beljakovin v Dpr1 + / + in Dpr1 - / - MEF v pogojih, bogatih s hranili in stradanjem ( n = 3). Izmerili smo in izračunali odstotek sproščanja 3 H-levcina, kot je opisano v materialih in metodah. * P <0, 05; ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD.

Slika v polni velikosti

Dpr1 se lokalizira na avtofagosom in spodbudi njegovo tvorbo

Ker je potrebna zaviranost mTOR za avtofogijo, ki izzveni iz lakote 5, 9, smo preizkusili, ali je prišlo do zaviranja avtofagije, posredovane z Dpr1, z zaviranjem mTOR aktivnosti. Pregled nivoja fosforiliranega S6K kot indikatorja aktivnosti mTOR je razkril, da Dpr1 ni imel učinka, a kot nadzor je stradanje odpravilo fosforilacijo S6K (dopolnilne informacije, slika S4A-S4B). Poročalo se je, da AMPK povzroča avtofagijo z direktno fosforiliranjem ULK1 27, 28 . Da bi preizkusili, ali bi lahko Dpr1 vplival na aktivnost AMPK, smo raziskali fosforilacijo ULK1 na ostanku Ser555 s strani AMPK in ugotovili, da brisanje Dpr1 ne vpliva na aktivnost AMPK v prisotnosti ali odsotnosti njegovega agonista A769662 29 (dopolnilne informacije, slika S4C). Avtofagija se sproži s tvorbo fagoforja (imenovanega tudi izolacijska membrana), ki zahteva PtdIns (3) P, ki ga tvori kompleks Vina34 kinaze, ki vsebuje Beclin1, Vps34, p150 in Atg14L 14, 16, 30 . Nato smo preučili, ali je Dpr1 urejal dejavnost tega kompleksa. Kot je prikazano na sliki 4A, je bil Atg14L-GFP difuzno porazdeljen v citoplazmi celic NRK (normalna podgana) pod pogoji, bogatimi s hranili. Vendar se je v celicah, ki so bile sočasno transficirane z Atg14L-GFP in DsRed-Dpr1, število pik Atg14L-GFP dramatično povečalo in te Atg14L-GFP pozitivne pike kolokalizirale in premikale skupaj z DsRed-Dpr1 v obeh bogatih s hranili in stradanje (slika 4A in dodatne informacije, slika S5A-S5B). Dpr1 tvori puncta v citoplazmi 18, 20, 31, 32, morda zaradi njegove samo agregacije. Da bi izključili možnost, da je Atg14L puncta povzročila preprosto najemanje na Dpr1 puncta, smo uporabili mikroskop Structured Illumination (SIM) za analizo punktatne strukture Atg14L, inducirane z Dpr1, in ugotovili, da je Dpr1 kolokaliziran z Atg14L, da nastane v obliki obroča ali omegasom podobni strukturi (slika 4B-b1, b2), ki spominja na stradanje Atg14L puncta (slika 4B-b4), kar je v nasprotju s trdno stavčno točko Dpr1 brez notranjega prostora, ko je bil Dpr1 sam prekomerno izražen (slika 4B-b3) . V skladu s tem so bile Atg14L puncta, ki jo povzroča Dpr1, redko kolokalizirana z endogenim ubikvitinom (dopolnilne informacije, slika S5C), kar nadalje kaže na to, da Atg14L ni bil preprosto vključen v beljakovinske agregate. Opazili smo tudi, da se Atg14L puncta, ki jo povzroči Dpr1, zmanjša v celicah ULK1 - / - (slika 4C), kar kaže, da je ULK1 potreben za nastanek Atg14L punkta, ki ga povzroča Dpr1. Ti podatki so skladni z ULK1, ki deluje kot gornji efektor kompleksa Beclin1-Vps34-Atg14L za spodbujanje avtofagije 33 . Imuno-EM analiza je tudi potrdila, da je bil Dpr1 kolokaliziran z Atg14L pri avtofagosomih (dodatne informacije, slika S5D). Ti podatki kažejo, da je Dpr1 mogoče ciljati na avtofagosome skupaj z Atg14L.

Image

Dpr1 se lokalizira na izolacijski membrani in spodbuja tvorjenje avtofagosomov. (A) So-lokalizacija DsRed-Dpr1 z Atg14L-GFP v celicah NRK. Točno število Atg14L je bilo količinsko določeno ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. *** P <0, 001. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (B) Analiza atributa Atg14L, ki jih povzroča Dpr1 s SIM. b1 in b2, celice so bile transfektirane z Atg14L-GFP in DsRed-Dprl; b3, celice so bile transficirane samo z DsRed-Dprl; b4, so bile celice transficirane samo z Atg14L-GFP ob 2-urnem stradanju. Tehtnice, 200 nm. (C) Imunofluorescentna analiza Atg14L puncta, ki jo inducira Dpr1 v ULK1 + / + in ULK1 - / - MEF. Celice smo 36 ur transficirali z GFP-Dpr1 in Atg14L-mCherry in jih fiksirali za analizo konfokalne slike. Številko Atg14L puncta smo količinsko opredelili ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (D) Konfokalno slikanje stabilnih celic NRK, stabilnih GFP-DFCP1, ki so bile transficirane z DsRed-Dpr1 v rastnem mediju. Število punkta DFCP1 je bilo količinsko opredeljeno ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. (E) Konfokalno slikanje stabilnih celic NRK, stabilnih na CFP-LC3, ki so bile transficirane z GFP-Dpr1. Število LC3 puncta je bilo količinsko opredeljeno ( n = 3). Tehtnice, 10 μm. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD.

Slika v polni velikosti

DFCP1 je indikator fagoforno povezanih PtdIns (3) P-obogatene tvorbe membrane iz endoplazemskega retikuluma 34 . GFP-DFCP1 je tvoril puncta po ekspresiji DsRed-Dpr1 in je bil delno kolokaliziran z DsRed-Dpr1 v celicah pod pogoji, bogatimi s hranili (slika 4D). Podobno je prekomerna ekspresija Dpr1 povzročila nastanek punkta LC3 (slika 4E). Poleg tega so bile GFP-LC3-pozitivne pike kolokalizirane z DsRed-Dpr1 pred in po zdravljenju stradanja (dodatne informacije, slika S5E). Ti rezultati skupaj kažejo, da Dpr1 spodbuja nastajanje avtofagosomov v začetnih korakih.

Da bi ocenili, ali ima Dpr1 funkcijo v kasnejših korakih, ko se avtofagosomi spojijo z lizosomi, smo izvedli konfokalno slikanje in ugotovili, da je bilo malo kolokalizacij med Dpr1 in avtolizosomskim / lizosomskim markerjem LAMP1 v LAMP1-CFP stabilnih NRK celicah (dodatne informacije, slika S6A), kar kaže, da Dpr1 ni zajet v avtolizosome ali lizosome. V skladu s tem je bil Dprl redko kolokaliziran s p62 puncta v LAMP1-CFP stabilnih NRK celicah (dodatne informacije, slika S6B). Poleg tega je bil Dpr1 po 8 urah stradanja dokaj stabilen (dopolnilne informacije, slika S6C), na njegovo raven beljakovin pa 6 ur ni vplivalo zdravljenje z BafA1, kar je učinkovito blokiralo razgradnjo LC3 (dodatne informacije, slika S6D). Ti podatki kažejo, da Dpr1 spodbuja avtofagijo predvsem v zgodnjih korakih, vendar ne deluje v avtolizomih.

Dpr1 je v interakciji s kompleksom Beclin1-Vps34-Atg14L

Nato smo preizkusili, ali Dpr1 sodeluje s kompleksom Atg14L-Beclin1-Vps34. Ko-imunoprecipitacijski test je pokazal, da je Dpr1, povezan z Beclin1 na ravni endogenih beljakovin (slika 5A), in Flag-Dpr1 znižal endogene Vps34, Beclin1 in Atg14L (slika 5B). Medsebojno delovanje med Dpr1 in Atg14L je bilo potrjeno tudi, ko so bile v celicah HEK293T prekomerno izražene (slika 5C). Interakcije Dpr1 z Beclin1 in Atg14L sta bili neposredni, kot kaže hibridni test kvasovk (dodatna informacija, slika S7A), medtem ko Dpr1 ni neposredno sodeloval z Vps34 in UVRAG. Dvl2 je bil uporabljen kot pozitiven nadzor za interakcijo Dpr1 18 . Preslikava domen je razkrila, da je N-konec Dpr1 medsebojno delovala z Beclin1 in Atg14L (slika 5D in dodatne informacije, slika S7B), kar se razlikuje od C-konca Dpr1 za Dvl2 18, 20 . Po drugi strani je Dpr1 interaktivno sodeloval z Beclin1 in Atg14L preko ostankov 144-272 fragmenta Beclin1 (slika 5E) in ostankov 71-180 fragmenta Atg14L (slika 5F), pri čemer sta oba vključevala domene 14 v navitju.

Image

Dpr1 je v interakciji s kompleksom Beclin1-Vps34-Atg14L. (A) Medsebojno delovanje med endogenim Dpr1 in Beclin1 v celicah HEK293T. IB, imuno bloting; IP, imunoprecipitacija; WCL, celični lizati. (B) Medsebojno delovanje med eksogeno eksprimirano Flag-Dpr1 in endogenimi Beclin1, Atg14L ali Vps34 v celicah HEK293T. (C) Združenje Atg14L in Dpr1. Po so-transfekciji z Flag-Atg14L in Myc-Dpr1, kot je navedeno, so bile celice HEK293T pobrane za imunoprecipitacijo proti zastavi, ki ji je sledilo imunobloting anti-Myc. Skupno ekspresijo beljakovin smo potrdili z imunoblotiranjem z WCL. (D) Dpr1 komunicira z Beclin1 prek N-konca. Celice HEK293T smo transficirali z različicami Flag-Beclin1 in Myc-Dpr1, kot je navedeno. Po 48 urah smo celice pobrali za analizo imunoprecipitacije. (E) Dpr1 je v interakciji z domeno navita tuljave (aa 142-272) Beclin1. Celice HEK293T smo transficirali s konstrukti, kot je navedeno, in jih pobrali za analizo imuno bloting. (F) Dpr1 je v interakciji z domeno navita tuljava (aa 71-180) Atg14L. Navedeni plazmidi smo bili transficirani v celice HEK293T in po 36 urah smo celice pobrali za imunoblotiranje.

Slika v polni velikosti

Dpr1 spodbuja sestavljanje kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in poveča aktivnost kpsaze Vps34

Da bi obravnavali učinek Dpr1 na kompleks Atg14L-Beclin1-Vps34, smo pregledali endogene interakcije Beclin1-Vps34 tako v celicah divjega tipa kot v Dpr1 - / - in ugotovili, da pomanjkanje Dpr1 zmanjša interakcijo v prisotnosti ali odsotnosti MG132 ali stradanja (Slika 6A in dodatne informacije, slika S8A). Še več, prekomerna ekspresija Dpr1 je izboljšala interakcijo za endogene in eksogeno eksprimirane proteine ​​(slika 6B in dodatne informacije, slika S8B), kar nadalje kaže, da lahko Dpr1 spodbuja Beclin1-Vps34 interakcijo. V skladu s podatki, pridobljenimi iz Dpr1 - / - MEF, se je medsebojno delovanje Beclin1-Vps34 zmanjšalo tudi v možganskih tkivih Dprl fl / fl ; miši Nestin-Cre (slika 6C).

Image

Dpr1 poveča tvorbo kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in aktivnost Vps34 kinaze. (A) Zmanjšana interakcija Beclin1-Vps34 v Dpr1 - / - MEF v prisotnosti ali odsotnosti 1 μM MG132 4 ure. Imunoprecipitirani Vps34 smo količinsko določili in normalizirali glede na količino Vps34 v WCL (celični lizati). (B) Ektopična ekspresija Dpr1 je izboljšala medsebojno delovanje Beclin1-Vps34 v celicah HEK293T. Imunoprecipitirani endogeni Vps34 smo količinsko opredelili in normalizirali glede na količino Vps34 v WCL. (C) Zmanjšano medsebojno delovanje Beclin1-Vps34 in Beclin1-Atg14L v možganski skorji 9-mesečnih Dpr1 fl / fl ; miši Nestin-Cre . Imunoprecipitirani endogeni Vps34 in Atg14L sta bila količinsko opredeljena in normalizirana glede na količino Vps34 in Atg14L v WCL. (D - F) Ektopična ekspresija Dpr1 je povečala interakcijo Atg14L-Vps34 (D), ni vplivala na interakcijo UVRAG-Vps34 (E), hkrati pa je zmanjšala interakcijo Rubicon-Vps34 (F) v celicah HEK293T. Celice smo transficirali z navedenimi plazmidi in jih po 36 h pobrali za imunoprecipitacijski test. (G) Povečana interakcija Rubicon-Beclin1 v Dpr1 - / - MEF. Imunoprecipitiran Rubicon je bil količinsko opredeljen in normaliziran glede na količino Rubicon v WCL. (H) Nadnatanti Dprl + / + in Dprl - / - MEF-lizatov so bili podvrženi analizi filtriranja z geli in imunoblotiranju, kot je opisano v materialih in metodah. (I) Vps34 aktivnost smo merili z analizo proizvodnje PtdIns (3) P s testom ELISA, opisanim v materialih in metodah ( n = 3). Sprememba krat PI (3) P je bila izračunana na podlagi koncentracije PI (3) P in normalizirana glede na kontrolno skupino GFP. ** P <0, 01 Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD.

Slika v polni velikosti

Kot poročajo, da Beclin1 in Vps34 obstajata v treh različnih populacijah: kompleks Atg14L-Beclin1-Vp34, ki olajša postopek avtofagije, in kompleks UVRAG-Beclin1-Vps34, ki je vključen v avtofigijo in trgovanje z endociti, ter Rubicon-UVRAG -Beclin1-Vps34 kompleks, ki zavira zorenje avtofagije 13, 14, 15, 16, smo preučili, ali je Dpr1 vplival na vse tri vrste kompleksov Beclin1-Vps34. Zanimivo je, da je prekomerna ekspresija Dpr1 povečala interakcijo Atg14L-Vps34 (slika 6D), ni vplivala na interakcijo UVRAG-Vps34 (slika 6E), hkrati pa je zmanjšala interakcijo Rubicon-Vps34 (slika 6F). V skladu s tem je bila interakcija Rubicon-Beclin1 povečana pri Dpr1 - / - MEF (slika 6G). Dpr1 lahko poleg tega sočasno imunoprecipitiramo z UVRAG, vendar ne z Rubiconom (dopolnilne informacije, slika S8C), in prekomerna ekspresija Dpr1 zmanjša interakcijo UVRAG-Rubicon (dodatne informacije, slika S8D). Ti podatki so v skladu s pozitivno vlogo Dpr1 pri regulaciji avtofagije. Poleg tega so Vps34, Beclin1 in Atg14L ponavadi tvorili večji kompleks v Dpr1 + / + MEF v primerjavi s tistimi v celicah Dpr1 - / -, kot kaže analiza z gel-filtracijo (slika 6H). V skladu s tem sta bila Beclin1 in Vps34 premaknjena v manjše molekularne frakcije pri novorojenčkih z okvaro Dpr1 (dopolnilne informacije, slika S8E). Dpr1 je tudi povečal aktivnost lipid kinaze Vps34 pri pretvorbi PtdIns v PtdIns (3) P, analiziran z testom ELISA ali tankoslojno kromatografijo (slika 6I in dodatne informacije, slika S8F). Ti podatki skupaj dokazujejo, da Dpr1 poveča tvorbo kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in aktivnost Vps34 kinaze.

Diskusija

Zbiranje dokazov razkriva, da ima avtofagija ključno vlogo pri tkivni homeostazi in različnih boleznih, kot so nevrodegeneracija in tumorji 35 . Vendar molekularni mehanizem za začetek avtofagije še vedno ni zelo jasen. V tej študiji smo zagotovili prepričljive dokaze, da ima Dpr1 ključno vlogo pri vožnji avtofagije. Spodbujanje avtofagije s pomočjo Dpr1 se zdi, da ne zavira aktivnosti mTOR in AMPK, ampak s povečanjem tvorbe kompleksa za avtofagijo Beclin1-Vps34-Atg14L in tako poveča aktivnost Vps34. Mogoče je, da lahko Dpr1 služi kot beljakovinski oder za stabilizacijo tega kompleksa ali pomaga pri zaposlovanju kompleksnih komponent.

Vps34 in njegov izdelek PtdIns (3) P igrata kritično vlogo pri trgovini z membranami 36, 37 . Opisane so bile tri različne podpopulacije kompleksa Beclin1-Vps34. Menili so, da kompleks Beclin1-Vps34, ki vsebuje Atg14L, deluje pri avtofagiji 14, 16, 38, kompleks UVRAG-Beclin1-Vps34 deluje v zorenju endosoma in retrogradnem prenosu Golgi-ER, medtem ko Rubicon-UVRAG-Beclin1-Vps34 kompleks zavira zorenje endosoma 14, 16, 39 . Ni pa znano, kako je urejena tvorba kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in s tem aktivnost Vps34. V tej študiji smo ugotovili, da bi lahko Dpr1 spodbujal avtofagijo z izboljšanjem sestavljanja kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 z neposrednim interakcijo z Atg14L in Beclin1. V skladu s tem so opazili zmanjšano medsebojno delovanje Beclin1-Vps34 in Beclin1-Atg14L v možganskih tkivih, specifičnih za nevrona, specifične za Dpr1 . Promocijski učinek Dpr1 na kompleksni sklop Atg14L-Beclin1-Vps34 se zdi specifičen, saj Dpr1 ne vpliva na interakcijo UVRAG-Vps34, ampak zmanjšuje interakcijo Rubicon-Vps34. Zanimivo je, da smo ugotovili, da lahko Dpr1 zmanjša interakcijo Rubicon-UVRAG. Ker je vpogled v Rubicon v kompleks Beclin1-Vps34 odvisen od UVRAG 14, 16, je smiselno, da Dpr1 zmanjšuje interakcijo Rubicon-Vps34 z zmanjšanjem interakcije Rubicon-UVRAG. Trenutno ni jasno, zakaj Dpr1 nima vpliva na interakcijo UVRAG-Beclin1, čeprav je povezan z UVRAG. Kljub temu ti podatki močno kažejo, da je Dpr1 nov in poseben pozitiven regulator za kompleks Atg14L-Beclin1-Vps34 v začetni fazi avtofagije. V skladu s tem je bil Dpr1 odporen proti avtofagični razgradnji in redko kolokaliziran z avtolizosomskim / lizosomskim markerjem LAMP1. Ker je Dpr1 pomemben regulator osnovnega kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in spodbuja aktivnost Vps34, je smiselno, da Dpr1 ne samo spodbuja bazalno avtofagijo, ampak tudi poveča avtofagijo, ki jo povzroča lakota. Pokazalo se je tudi, da izguba drugega beljakovine, povezane z beljakovino Ambra1, moti medsebojno delovanje Beclin1-Vps34, ki je potrebno tako za bazalno kot za stradanje avtofagijo 40 .

V skladu s pomembno funkcijo Dpr1 v avtofagiji smo ugotovili, da ablacija Dpr1 v centralnem živčnem sistemu povzroči kopičenje vseprisotnih beljakovin in razvoj nevrodegenerativnih bolezni, kar spominja na fenotipe nevronskih specifičnih ATG -knockout miši 6, 7, 17 . Miške z ablacijo Atg5 ali Atg7 v centralnem živčnem sistemu so pokazale motorične in vedenjske okvare v 3 tednih po rojstvu, patološke spremembe pa so opazili med 6 in 8 tedni, vključno s kopičenjem vseprisotnih beljakovin in izgubo Purkinjevih celic, zvišanjem apoptoze in marker nevronske poškodbe GFAP. Vse te fenotipe smo opazili pri miših Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre miših, vendar v veliko poznejših časovnih točkah. Mišice Dpr1 fl / fl ; Nestin-Cre miši so pokazale nenormalno motorično koordinacijo po 12 tednih in druge patološke spremembe po 7 mesecih. Ta zamuda kaže, da Dpr1 ni bistveni sestavni del procesa avtofagije, ampak deluje kot pomemben regulator. Na podlagi naših podatkov in vivo in in vitro sklepamo, da Dpr1 deluje kot pozitiven regulator za pospeševanje tvorbe kompleksa Atg14L-Beclin1-Vps34 in s tem povečuje avtofagično aktivnost.

Člani družine Dpr najdemo le v vretenčarjih, ne pa tudi pri nevretenčarjih, kot je drozofila . Človeški Dpr1 ima visoko homolognost z Xenopusom Dpr1 (55% enakih v aminokislinah) in mišjim Dpr1 (75% enakim). Ker imata človeški Dpr1 in mišji Dpr1 isto funkcijo pri spodbujanju avtofagije, je verjetno, da je ta funkcija ohranjena za vse Dpr1, vendar je ta hipoteza potrebna v prihodnje preveriti.

Materiali in metode

Miši

Običajne miške Dprl- knockout so bile predhodno opisane 19 . Miše Dpr1 fl / fl so bile ustvarjene z nadomestitvijo obeh eksonov 2 in 3 v modelnem raziskovalnem centru živali na univerzi Nanjing. Nato smo miši parili z mišmi Nestin-Cre in Alb-Cre (laboratorij Jackson), da so ustvarili Dpr1, ki je specifičen za nevrone in jetra. Transgenične miši GFP-LC3 smo kupili pri BioResource centru RIKEN. Vse miši so eksperimentirale v skladu s smernicami Odbora za institucionalno nego in uporabo živali Univerze Tsinghua. Oligo za genotipizacijo je bil naslednji: prednji temeljni premaz (5 '-GCAGGTTAGGCGTCTTTATGGCT-3') in povratni temeljni premaz (5 '-GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG-3'). Alel Dpr1 fl / fl prikazuje pas 302 bp.

Celična kultura, transfekcija in stradanje

Stabilne celice HEK293T, NRK-GFP-DFCP1, NRK-LAMP1-CFP in NRK-CFP-LC3 smo gojili v DMEM, ki je vseboval 10% fetalnega govejega seruma (FBS; Hiklona), dopolnjenega s 4 mM L-glutamina v 5% CO 2 pri 37 ° C in ga v skladu s priporočili proizvajalca prenesli Vigofect (Vigorous Biotechnology, Peking). Primarni MEF so bili ustvarjeni iz 13, 5-dnevnih zarodkov in vzdrževani v DMEM, dopolnjenem z 10% FBS. ULK1 + / + in ULK1 - / - MEF je lepo nadaril dr. Jun-Lin Guan. Vsi poskusi so bili izvedeni s celicami v normalnem rastnem mediju (stanje bogate s hranili), če ni posebej navedeno. Za stradanje smo celice trikrat sprali s PBS in jih gojili v Hanksovi uravnoteženi raztopini soli (HBSS, Invitrogen).

Plazmidi, protitelesa in reagenti

Človeška Dpr1 cDNA smo klonirali v pEGFP-C3, da bi ustvarili GFP-Dprl. KDNA človeške Vps34 smo klonirali na mesta Kpn I- Xba I pcDNA3.1 (+) - HA ali pCS2 (+) - zastave vektorja. Zastava-Beclin1 je bilo darilo dr. Honggang Wang-a. P62-GFP je darilo dr. Terje Johansen. Dvl2 smo klonirali na Bam HI mesto pDsRed-N1. Atg14L smo klonirali iz Atg14L-GFP v mesta Eco RI- Sal I pmCherry-N1. Dpr1 shRNA so bili kupljeni od odprtih biosistemov. MG132 je bil iz Calbiochema in pripravljen kot 100 mg / ml v DMSO. BafA1, rapamicin in XAV939 smo dobili od Sigme. A769662 je bil iz podjetja Abcam. Protitelesa vključujejo: mišji anti-kalbindin (Sigma), kunčji anti-GFAP (Bioss, Peking), mišji anti-ubikvitin (FK2 MBL), mišji anti-Beclin1 (BD Biosciences), zajec anti-Beclin1 (MBL), zajec proti- Vps34 (celična signalizacija), kunčji anti-Atg14L (MBL), mišji proti zastavi M2 (Sigma), zajec anti-Dvl2 (celična signalizacija), mišji protitubulinski in anti-GFP (Santa Cruz Biotech), mišji anti-p62 in zajec proti LC3 (MBL).

Kvantitativni PCR v realnem času

Skupna RNA je bila pripravljena z uporabo TRIzola (Invitrogen) in cDNA je bila sintetizirana iz 1 μg RNA z Revertra Ace (Toyobo). Kvantitativno-RT-PCR smo izvedli z odkrivanjem Eva Green s pomočjo LC480 kvantitativnega PCR sistema (Roche). Primeri so bili naslednji: človeški Dpr1 (5 '-CATCCGGCAAGGTAC-3' in 5 '-AGGCACCAAGTGTGG-3'), miška Dact1 (5 '-ACATCTTGCTGCTGCGAAGGC-3' in 5 '-CGGCTGTCTGTCTGTC)

Analiza gelske filtracije

MEF smo homogenizirali v 1, 2 ml ledeno hladnega puferja za homogenizacijo (50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, popolni koktajl zaviralca proteaze (Roche) in zaviralci fosfataze). Jetrna tkiva smo ekstrahirali in homogenizirali s pufrom za homogenizacijo in 2 min sonificirali na ledu. Vzorce smo 30 minut pri 4 ° C centrifugirali pri 14 000 vrt./min. Tako dobljeni supernatanti so bili uporabljeni za filtracijo z geli na koloni Superose 6 10/300 GL z uporabo hitro tekočinske tekočinske kromatografije (GE Healthcare) in eluirani s hitrostjo pretoka 0, 5 ml / min. Frakcije smo oborili s trikloroocetno kislino (TCA) in pregledali z imunoblotingom.

Vps34 kinazni test

Ekogenizirano v celicah HEK293T, označenega z zastavico, smo imunoprecipitirali in podvrgli preizkusu aktivnosti Vps34 kinaze, kot je opisano 16 . Aktivnost Vps34 smo izmerili tudi s kompletom ELISA razreda III PI3K (Echelon, Lot # KE120612). Flag-Vps34, HA-Beclin1 in HA-Vps15 so bili transficirani v celice HEK293T z ali brez GFP-Dpr1 ali GFP-Atg14L plazmida. Vps34 smo imunoprecipitirali z uporabo protitelesa proti zastavi M2 in ga uporabili za test ELISA po navodilih proizvajalca. Na kratko dodamo 20 μl reakcijski pufer kinaze (10 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA in 10 mM MnCl 2 ), 4 μl 500 μM PI (fosfatidilinozitola) substrata in 1 μl 1, 25 mM ATP. kroglice imunoprecipitirane z Vps34 in inkubiramo 1 uro pri 37 ° C. Nato smo reakcijsko zmes pogasili s 5 μl 100 mM EDTA, razredčili s 130 μl H20 in 40 μl PI (3) P zaznavalnim pufrom (priskrbel Kit, K-3004). Na koncu smo kitajsko reakcijsko zmes in PI (3) P detektorski protein (zagotovili komplet) dodali skupaj na mikroploščico, prevlečeno s PI (3), da bi se konkurenčno vezali na detektorski protein PI (3) P. Količino proteina PI (3) P detektorja, vezano na ploščo, določimo s koloimetričnim odkrivanjem absorbance pri 450 nm. Koncentracijo PI (3) P v reakcijski mešanici smo izračunali kot obrnjeno na količino proteina detektorja PI (3) P, ki je vezan na ploščo.

Dvo hibridna analiza kvasovk

Dvo hibridni postopek kvasa je bil opisan prej 41 . Različice Dpr1 so bile klonirane na mesto kloniranja vektorja pGBKT7 (Clontech). Celotni Atg14L, Beclin1, Vps34, UVRAG in Dvl2 so bili klonirani v pGADT7. Kvas AH109 smo posamično transformirali z navedenimi plazmidi in ga s serijskim redčenjem opazili na sintetičnih ploščicah s pomanjkanjem histidin-adenin-levcin-triptofan. Transformirane celice so gojile pri 30 ° C 3-4 dni, slike pa je posnel digitalni fotoaparat (Nikon).

Imunofluorescentna mikroskopija, imuno bloting in imunoprecipitacija

Immunofluorescence analysis, immunoblotting and immunoprecipitation were performed as previously described 20, 42 . Tubulin served as a loading control for immunoblotting. For live cell imaging, the cells transfected with the indicated plasmids were cultured in growth medium for 24 h, and then directly monitored for the indicated times by a spin-disk microscope (REVOLUTION xD, ANDOR). The number of Atg14L-GFP, Atg14L-mCherry, GFP-DFCP1, CFP-LC3 and LAMP1-CFP puncta were measured by Image-ProPlus software. These measurements were done on randomly selected fields of view.

Analiza imunoelektronske mikroskopije

NRK cells were transfected with Flag-Dpr1 and GFP-Atg14L for 36 h, and first fixed with 2% paraformaldehyde and 0.6% glutaraldehyde in PBS (pH 7.4) at 37 °C for 1 h, and then with 0.2% osmic acid for another 45 min. The cells were dehydrated in a graded ethanol series and embedded in acrylic resin (LR White). 70-nm ultrathin sections were mounted in 2% BSA/PBS and 0.2% gelatin/PBS for 2 h, then incubated with a mixture of anti-Flag M2 antibody (1:50) and anti-GFP antibody (1:50) in 2% BSA/PBS overnight at 4 °C, washed three times in 0.2% BSA/PBS and then labeled with 6 nm goat anti-mouse immunogold particles and 12 nm goat anti-rabbit immunogold particles in 2% BSA/PBS for 2 h. Grids were finally washed three times in PBS and three times in distilled water, stained and dried at room temperature. The sections were visualized with a 120 kV electron microscope (H-7650B, Hitachi) at 80 kV and images were captured using an AMT V600 digital camera (Advanced Microwave Technologies).

SIM analysis

Cells transfected with the indicated plasmids were fixed with 4% paraformaldehyde, permeated with 0.2% Triton X-100, and incubated with primary antibodies and then second antibodies. Images were captured and processed with a Nikon's Structured Illumination Microscope (N-SIM).

Long-lived protein degradation assay

The experiment was performed following the protocol described by Mizushima et al . 43 . Briefly, the cells were incubated with 3 H-labeled leucine for 48 h, and then refreshed with cold leucine medium for another 12 h to release short-lived proteins. After the chase period, the cells were changed into DMEM or HBSS containing 2 mM leucine. After another 6-h incubation, the medium was collected and the TCA-soluble fraction was analyzed by scintillation counting. Total cell radioactivity was measured after lysis with 0.1 M NaOH. 3 H-labled leucine release was calculated as a percentage of the radioactivity in TCA-soluble fraction to the total cell radioactivity.

Imunohistokemija

Dpr1 +/+ ;Nestin-Cre and Dpr1 fl/fl ;Nestin-Cre mice were fixed by cardiac perfusion with 0.1 M phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde. Then, the tissues were dissected and fixed in 4% paraformaldehyde at 4 °C overnight, dehydrated, embedded in Optimal Cutting Temperature compound (lot 4583) (SAKURA), sectioned at 10 μm by freezing microtome as previously described 19 . For immunohistochemical staining, primary antibodies were incubated at 4 °C overnight and secondary antibodies were incubated for 1 h at room temperature, followed by diaminobenzidine staining (Zsbio, Beijing, China). For PAS (Periodic Acid-Schiff) staining, glycogen was detected by PAS assay using PAS Kit (Sigma). All the sections were examined under an Olympus light microscope with a digital camera. For immunofluorescence staining, primary antibodies were incubated at 4 °C overnight and secondary antibodies were incubated for 2 h at room temperature. All the pictures were captured by a LSM710 microscope (Zeiss).

Statistična analiza

For immunofluorescence, quantification was derived from at least 20 cells in each of the three independent experiments. For immunohistochemistry, quantification was derived from at least three sections in each of the three independent experiments. n represents the number of independent experiments used for statistical analysis. Statistical analyses were performed using a two-tailed unpaired t -test. P <0, 05 je bil ocenjen kot statistično pomemben.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije, slika S1

    Loss of Dpr1 leads to neurodegenerative disorder.

  2. 2

    Dodatne informacije, slika S2

    Dpr1 knockout contributes to dysfunction of mouse livers by impairment of basal autophagy.

  3. 3.

    Dodatne informacije, slika S3

    Loss of Dpr1 impairs the LC3 lipidation independent of Wnt signaling.

  4. 4.

    Dodatne informacije, slika S4

    Dpr1 doesn't influence mTOR and AMPK activity as indicated by S6K and ULK1 phosphorylation.

  5. 5.

    Dodatne informacije, slika S5

    Dpr1 is targeted to autophagosomes together with Atg14L and LC3.

  6. 6.

    Dodatne informacije, slika S6

    Dpr1 doesn't function in autolysosomes.

  7. 7.

    Dodatne informacije, slika S7

    Dpr1 interacts with Beclin1 and Atg14L as shown by yeast two-hybrid assay.

  8. 8.

    Dodatne informacije, slika S8

    Dpr1 enhances the interaction between Beclin1 and Vps34 and increases Vps34 kinase activity.

Videoposnetki

  1. 1.

    Dodatne informacije, Movie S1

    Dpr1fl/fl;Nestin-Cre mice show motor coordination defects in a rotarod assay. The rotarod accelerated uniformly from 0 to 40 rpm. Dpr1fl/fl;Nestin-Cre mice (exampled at left) fell off the rotarod between 70s to 100s after the rotarod began rotating, while most Dpr1+/+;Nestin-Cre mice (exampled at right) could walk on the rotarod for more than 150s.

    ( Dodatne informacije so povezane s spletno različico prispevka na spletni strani Cell Research .)