Primerjalna genomika razkriva mobilne patogene kromosome v fusariju | naravo

Primerjalna genomika razkriva mobilne patogene kromosome v fusariju | naravo

Anonim

Predmeti

  • Primerjalna genomika
  • Prenosljivi elementi DNK
  • Gljivična patogeneza

Izvleček

Vrste fusarium spadajo med najpomembnejše fitopatogene in strupene glive. Da bi razumeli molekularne podlage patogenosti v rodu Fusarium , smo primerjali genome treh fenotipsko različnih vrst: Fusarium graminearum , Fusarium verticillioides in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici . Naša analiza je razkrila genske regije, specifične za ločitev (LS) v F. oxysporum, ki vključujejo štiri celotne kromosome in predstavljajo več kot eno četrtino genoma. LS regije so bogate s transpozoni in geni z izrazitimi evolucijskimi profili, vendar so povezani s patogenostjo, kar kaže na vodoravno pridobivanje. Eksperimentalno prikazujemo prenos dveh LS kromosomov med sevi F. oxysporum , ki pretvori nepatogeni sev v patogen. Prenos LS kromosomov med sicer gensko izolirane seve pojasnjuje polifiletični izvor gostiteljske specifičnosti in pojav novih patogenih rodov v F. oxysporum . Te ugotovitve postavljajo razvoj patogenosti gliv v novo perspektivo.

Glavno

Vrste fusarium spadajo med najbolj raznolike in široko razpršene rastlinsko-patogene glive, ki povzročajo gospodarsko pomembne klopi, koreninske gnilobe ali zavezo 1 . Nekatere vrste, na primer F. graminearum ( Fg ) in F. verticillioides ( Fv ) imajo ozek gostiteljski razpon, ki okužijo pretežno žita (slika 1a). F. oxysporum ( Fo ) ima v nasprotju s tem izjemno širok razpon gostiteljev, ki okužijo monokotiledonne in dvodomne rastline 2 in je nastajajoč povzročitelj imunsko oslabljenih ljudi 3 in drugih sesalcev 4 . Različne razlike v prilagodljivosti in specifičnosti gostiteljev se vrste Fusarium razlikujejo tudi v reproduktivni strategiji. Nekateri, kot je Fo , so aseksualni, drugi pa so aseksualni in spolni bodisi s samoplodnostjo (homotalizem) bodisi z obligacijskim prehodom (heterotalizem) (sl. 1b).

Image

a, drevo z največjo verjetnostjo, ki uporablja vezane beljakovinske sekvence 100 genov, naključno izbranih med 4.694 ortolognimi geni Fusarium, ki imajo med Fusarium genomi jasno 1: 1: 1 in imajo edinstvene ujeme v Magnaporthe grisea , Neurospora crassa in Aspergillus nidulans . Drevo je bilo zgrajeno s PHYML 35 (WAG model evolucije 36 ). Podružnice so označene s odstotkom 10.000 ponovitev zagona. b - d, fenotipska variacija v rodu Fusarium : b, bolezenski simptomi koruze (od zgoraj navzdol), gniloba koruze ( Fv ), gniloba paradižnika ( Fol ), plesen pšenice ( Fg ) in gniloba graha ( Fs) ); c, perithecialna stanja Fv ( Gibberella moniliformis ), Fol (brez spolnega stanja), Fg ( G. zeae ) in Fs ( Nectria haematococca ); in d, mikro- in makrokonidij Fv , Fol , Fg in Fs . Tehtnice, 10 µm. Fg proizvaja samo makrokonidijo.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Pred tem so genom žitnega patogena Fg sekvencirali in pokazali, da kodira večje število beljakovin v družinah proteinov povezanih s patogenostjo v primerjavi z nepatogenimi glivami, vključno s predvidenimi transkripcijskimi faktorji, hidroliznimi encimi in transmembranskimi prenašalci 5 . Sekvencirali smo dve dodatni vrsti Fusarium , Fv , patogen koruze, ki proizvaja mikotoksine fumonisin, ki lahko kontaminirajo zrno, in F. oxysporum f.sp. lycopersici ( Fol ), paradižnikov patogen . Tukaj predstavljamo primerjalno analizo genomov teh treh vrst.

Rezultati

Organizacija genomov in genske skupine

Sekvencirali smo sev Fv 7600 in sev Fol 4287 (Metode, dodatna tabela 1) z uporabo celovitega genomskega puško in zaporedje sestavili z uporabo Arachne (tabela 1, ref. 6). Razvrstitev kromosomskih odrov je bila dosežena s pritrditvijo sklopov na genetsko karto za Fv (ref. 7) ali na optično karto za Fol (dopolnilne informacije A in dodatna tabela 2). Napovedali smo gene Fol in Fv in ponovno opomnili novo sestavo genoma Fg z uporabo kombinacije ročnih in avtomatiziranih komentarjev (dodatne informacije B). Fol genom (60 megabaz) je približno 44% večji od vrste njegovih najbolj sorodnih vrst, Fv (42 Mb) in 65% večji od vrste Fg (36 Mb), kar ima za posledico večje število genov, ki kodirajo beljakovine v Fol (tabela 1).

Tabela polne velikosti

Povezanost treh genov Fusarium je omogočila generiranje nedvoumnih poravnav v obsežnem obsegu (dopolnilne slike 1–3) in določanje ortoloških genskih nizov z veliko zaupanjem (Metode, dopolnilne informacije C). V povprečju ortologi Fol in Fv prikazujejo 91% identifikacijo nukleotidnega zaporedja, oba pa imata 85% identiteto s kolegoma Fg (dodatna slika 4). Med tremi genomi je bilo ugotovljenih več kot 9.000 ohranjenih sintetičnih ortologov. V primerjavi z drugimi genoma askomiceta so ti tri vrste ortologi obogateni za predvidene transkripcijske faktorje ( P = 2, 6 × 10 -6 ), litične encime ( P = 0, 001) in transmembranske prenašalce ( P = 7 × 10 -9 ) (Dodatne informacije C in dopolnilne tabele 3–8) v skladu z rezultati, ki so jih poročali o genomu Fg 5 .

Vrste fusarija proizvajajo različne sekundarne presnovke, vključno z mikotoksini, ki kažejo toksičnost za ljudi in druge sesalce 8 . V treh genomih smo identificirali skupno 46 grozdnih skupin biosinteze sekundarne presnovke (SMB). Microarray analize so potrdile so-ekspresijo genov v 14 od 18 Fg in 10 od 16 Fv SMB genskih grozdov. Deset od 14 Fg in osem od 10 Fv sopredstavljenih genskih grozdov SMB je novo (Dopolnilne informacije D, Dopolnilna slika 5 in Dopolnjena tabela 9 ter spletni materiali), ki poudarjajo potencialni vpliv nerazvrščenih sekundarnih metabolitov na glivice biologija.

Linijski specifični kromosomi in patogenost

Sklop gena Fol ima 15 kromosomov, Fv sklop 11 in Fg sklop le štiri (tabela 1). Manjše število kromosomov v Fg je posledica zlivanja kromosomov glede na Fv in Fo , fuzijska mesta v Fg pa se ujemajo s prej opisanimi območji z visoko raznolikostjo (dopolnilo Slika 3, ref. 5). Globalna primerjava med tremi geni Fusarium kaže, da je povečano genomsko ozemlje v Fol posledica dodatnih, edinstvenih sekvenc, ki živijo večinoma v dodatnih kromosomih. Sintenične regije v Fol pokrivajo približno 80% Fg in več kot 90% Fv genoma (dopolnilne informacije E in dodatna tabela 10), ki jih imenujemo "jedro" genomov. Razen telomere-proksimalnih regij, vseh 11 preslikanih kromosomov v sestavi Fv (41, 1 Mb) ustreza 11 od 15 kromosomov v Folu (41, 8 Mb). V teh kromosomih se vzdržuje kolinearni vrstni red genov med Fol in Fv , razen enega kromosomskega translokacijskega dogodka in nekaj lokalnih preureditev (slika 2a).

Image

a, Argo 37 pikapolonica poravnave MEGABLAST v paru (1 × 10 -10 ) med Fv in Fol, ki prikazuje kromosomska ujemanja med obema genomoma v črnih črtkanih poljih. Navpične modre črte ponazarjajo kromosomske translokacije, rdeče črtkane vodoravne škatle pa poudarjajo kromosome Fol LS. b, Globalni pogled na sintetične poravnave med Fol in Fv in razporeditev premičnih elementov. Fol- povezne skupine so prikazane kot referenčne, dolžina svetlo sivega ozadja za vsako povezovalno skupino pa je določena z Fol optičnim zemljevidom. V vsakem kromosomu vrstica i predstavlja genske odre, nameščene na skupinah optičnih vezi, ločenih z lomi odrov. Številke odrov za Fol so navedene nad bloki; vrstica ii prikazuje sintetično preslikavo Fv kromosomov z enim glavnim premikom med chr 4 / chr 12 v Fol in chr 4 / chr 8 v Fv ; vrstica iii predstavlja gostoto premičnih elementov, izračunano z oknom 10 kb. LS kromosomi vključujejo štiri celotne kromosome (chr 3, chr 6, chr 14 in chr 15) in dele kromosoma 1 in 2 (ogrodje 27, ogrodje 31), ki nimajo podobnosti s sintetičnimi kromosomi v Fv, a so obogateni za TE. c, Dva od štirih kromosomov Fol LS, ki prikazujeta inter- (zeleno) in intra (rumeno) kromosomsko segmentno podvajanje. Spodnje tri sledi so gostota porazdelitve TE (modre črte), izločeni proteinski geni (zelene črte) in geni, povezani z metabolizmom lipidov (rdeča črta). Chr, kromosom; Un, nenapisana.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Edinstvene zaporedje Fol predstavljajo velik delež (40%) sklopa Fol , ki je označen kot območja, značilna za Fol linijo ( Fol LS), da jih ločimo od ohranjenega jedra genom. Področja Fol LS vključujejo štiri celotne kromosome (kromosome 3, 6, 14 in 15), dele kromosoma 1 in 2 (ogrodje 27 in ogrodje 31) in večino majhnih odrov, ki niso zasidrani na optični zemljevid (sl. 2b). Skupaj regije Fol LS obsegajo 19 Mb, kar predstavlja skoraj vse večje velikosti gena Fol .

Zlasti regije LS vsebujejo več kot 74% prepoznavnih prenosnih elementov (TE) v genomu Fol , vključno s 95% vseh transpozonov DNA (slika 2b, dopolnilna slika 6 in dodatna tabela 11). V nasprotju z nizko vsebnostjo ponavljajočega zaporedja in minimalno količino TE v genoma Fv in Fg (tabela 1 in dodatna tabela 11) je bilo približno 28% celotnega Fol genoma opredeljeno kot ponavljajoče sekvence (metode), vključno s številnimi retroelementi ( retrotransposoni LTR, podobni copiji in v obliki ciganov , LINE (dolgi intersperzirani jedrski elementi) in SINE (kratki intersperzirani jedrski elementi) in DN- transpozoni ( Tc1-mariner , hAT- podobni, mutatorji in MITE) (dopolnilne informacije E.3 ), pa tudi več velikih segmentarnih podvajanj. Veliko TE-jev je v celotni dolžini in so zelo podobne kopije. Še posebej dobro zastopani DNA transposonski razredi v Fol so pogo , hAT- podobni elementi in MITE-ji (skupaj približno 550, 200 in 350 izvodov) Poleg tega obstajata eno intra-kromosomsko in dve medhromosomsko segmentacijski podvoji, skupaj približno 7 Mb, kar ima za posledico tri- ali celo štirikratno podvajanje nekaterih regij (slika 2c)., te regije imajo 99-odstotno identiteto zaporedja (dodatna slika 7), kar kaže na nedavne dogodke podvajanja.

Le 20% predvidenih genov v regijah Fol LS je bilo mogoče funkcionalno razvrstiti na podlagi homologije z znanimi proteini. Ti geni so znatno obogateni ( P <0, 0001) za funkcionalne kategorije „izločeni efektorji in virulenčni faktorji“, „transkripcijski faktorji“ in „proteini, ki sodelujejo pri transdukciji signala“, vendar nimajo genov za funkcije vzdrževanja (dodatne informacije E in dopolnilne tabele 12–18). Med geni s predvideno funkcijo, povezano s patogenostjo, so bili znani efektorski proteini (glej spodaj), pa tudi nekroza in peptidi, ki inducirajo etilen 9, in različni izločeni encimi, za katere se predvideva, da bodo razgradili ali spremenili rastlinske ali glivične celične stene (dopolnilne informacije E in dopolnilne snovi) Tabele 14, 15). Zlasti se veliko teh encimov izrazi v zgodnjih fazah okužbe s koreninami paradižnika (dopolnilni tabeli 15, 16 in dodatna slika 8). Širitev genov za presnovo lipidov in sekundarnih glasnikov, pridobljenih iz lipidov, v regijah Fol LS kaže na pomembno vlogo za lipidno signalizacijo pri glivični patogenosti (dopolnilna slika 9 in dopolnilne tabele 13, 17). Družina sekvenc faktorjev transkripcije, povezanih s FTF1 , genom, ki je bil posebej prepisan v zgodnjih fazah okužbe z F. oxysporum f. sp. Phaolioli (dopolnilne informacije E in dopolnilna tabela 4; ref. 10) je prav tako razširjen.

Nedavno objavljeni genom F. solani 11, bolj razhajane vrste, nam je omogočil, da primerjalno analizo razširimo na širši evolucijski okvir (slika 1). Medtem ko so glavni jedri genskih celic dobro ohranjeni med vsemi štirimi sekvenciranimi vrstami Fusarium , regije Fol LS prav tako niso prisotne v Fs (dopolnilna slika 2). Poleg tega ima Fs tri LS kromosome, ki se razlikujejo od jedra 11 genoma in regij Fol LS. Za zaključek ima vsaka od štirih vrst Fusarium jedrni genom z visoko stopnjo sinteze, medtem ko imata Fol in Fs kromosome LS, ki se razlikujejo glede na ponavljajoča sekvence in gene, povezane z interakcijo gostitelj-patogen.

Izvor regij LS

Upoštevane so bile tri možne razlage o izvoru regij LS v genomu Fol : (1) Fol LS regije so bile prisotne pri zadnjem skupnem predniku štirih vrst Fusarium, vendar so bile nato v navpičnih linijah Fv , Fg in Fs selektivno in neodvisno izgubljene prenos; (2) LS regije so nastale iz jedra genoma z podvajanjem in razhajanjem znotraj roda Fol ; in (3) regije LS so bile pridobljene s horizontalnim prenosom. Za razlikovanje med temi hipotezami smo primerjali značilnosti zaporednosti genov v regijah Fol LS z značilnostmi genov v jedrih regije Fusarium in genov v drugih nitastih glivah. Če imajo geni Fol LS v drugih vrstah Fusarium jasne ortologe ali paraloge v osrednjem območju Fol , bi to pripomoglo k vertikalnemu prenosu ali podvajanju s hipotezami razhajanja. Ugotovili smo, da ima 90% genov Fol v osrednjih regijah homologe v drugih dveh genomih Fusarium , približno 50% genov na regijah Fol LS pa nima homologov niti v Fv ali Fg (1 × 10-20 ). Poleg tega je med ortologi Fol in Fv v jedrnih regijah manj razlik v zaporedju v primerjavi z ortologi Fol in Fg (slika 3a), kar je skladno z vrsto filogenije. V nasprotju s tem so geni LS, ki imajo homologe v drugih vrstah Fusarium , približno enako oddaljeni tako od genov Fv kot Fg (slika 3b), kar kaže na to, da se filogenetska zgodovina genov LS razlikuje od genov v osrednjem območju genoma.

Image

Razširitvene ploskve razmerja BLAST (BSR) 30 na podlagi tristranskih primerjav beljakovin, kodiranih v jedrnih regijah ( a ), in kromosomov Fol LS ( b ). Številke označujejo odstotek genov, ki nimajo homolognih zaporedij v Fv in Fg (spodnji levi kot), ki so prisotni v Fv, vendar ne Fg ( x -os) in prisotni v Fg, ne pa v Fv ( y- osi). c, Neskladno filogenetsko razmerje beljakovin, kodiranih v LS regijah. Drevo največje verjetnosti je bilo konstruirano z uporabo sočasnih beljakovinskih zaporedij 100 genov, naključno izbranih iz 362 genov, ki si delijo homologe v sedem izbranih genomov askomiceta, vključno s štirimi genomi Fusarium , M. grisea , N. crassa in A. nidulans . Drevesa so zgradili s programom PHYML 35 (WAG model evolucije 36 ). Odstotek za podružnice predstavlja vrednost, ki temelji na naboru 10.000 zagonskih podatkov.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Obe tabeli uporabe kodona in analiza indeksa prilagajanja kodona (CAI) kažeta, da geni, ki kodirajo LS, kažejo različno uporabo kodona (dodatne informacije E.5, dopolnilna slika 10 in dodatna tabela 19) v primerjavi z ohranjenimi geni in geni v Fv genoma, ki še naprej podpira njihov izrazit evolucijski izvor. Najpomembnejše razlike so opazili pri aminokislinah Gln, Cys, Ala, Gly, Val, Glu in Thr, s prednostjo G in C nad A in T med geni Fol LS (Dodatna tabela 20). Takšna pristranskost GC se kaže tudi v nekoliko višji vsebnosti GC v njihovih tretjih položajih kodona (dopolnilna slika 11).

Od 1.285 beljakovin, kodiranih z LS, ki imajo homologe v naboru proteinov NCBI, ima skoraj vsi (93%) svoj najboljši BLAST hit druge glive askomiceta (dopolnilna slika 12), kar kaže, da so regije LS LS glivičnega izvora. Filogenetska analiza, ki temelji na sočasnem vzorčenju 362 beljakovin, ki si delijo homologe v sedmih izbranih genoma askomiceta - vključno s štirimi sekvenciranimi genomi Fusarium , Magnaporthe grisea 12, Neurospora crassa 13 in Aspergillus nidulans 14 - svoj izvor postavijo v rod Fusarium, vendar bazalno za tri najbolj sorodne vrste Fusarium Fg , Fv in Fol (slika 3c, dodatna tabela 21). Skupaj sklepamo, da je vodoravno pridobivanje druge vrste Fusarium najbolj prizorno pojasnilo nastanka regij Fol LS.

LS regije in gostiteljske posebnosti

F. oxysporum velja za vrsto vrst, sestavljeno iz številnih različnih aseksualnih rodov, ki so lahko patogeni do različnih gostiteljev ali nepatogeni. Področja Fol LS se med sevi Fo z različnimi značilnostmi gostitelja bistveno razlikujejo, kar je določeno s sekvenco Illumina zaporedja seva Fo Fo76, patogena sekvence Arabidopsis 15 in EST (izražena zaporedna oznaka) iz Fo f. sp. vasinfectum 16, povzročitelj bombaža (dopolnilne informacije E.2). Kljub manj kot 2% skupne razlike v zaporedju med deljenimi sekvencami Fol in Fo 5176 (dopolnilna slika 13A), za večino sekvenc v regijah Fol LS ni nobenega protipostavka v foliji 5176. (dodatna slika 13B). Tudi sekvence Fov EST 16 imajo zelo visoko identičnost nukleotidnega zaporedja do genom Fol (povprečno 99%), vendar se ujemajo le z jedrnimi območji Fol (dopolnilne informacije E.2). Polimorfizem velikega gena znotraj Fo se kaže tudi po razlikah v kariotipu med sevi (dopolnilna slika 14) 17 . Pred glivicama Nectria heematococca 18 in Alternaria alternata 19 so poročali o majhnih, polimorfnih in pogojno dispenzijskih kromosomih, ki zagotavljajo gostiteljsko specifično virusnost . Majhni (<2, 3 Mb) in variabilni kromosomi so odsotni v nepatogenih izolatih F. oxysporum (dopolnilna slika 14), kar kaže, da so lahko kromosomi Fol LS tudi posebej vključeni v patogeno prilagoditev.

Prenos kromosomov patogenosti Fo

Dobro je dokumentirano, da se pri kolonizaciji sistema 20, 21 paradižnikovega ksilema izločajo majhne beljakovine, vsaj dva od teh pa Six1 (Avr3) in Six3 (Avr2) sodelujeta pri funkcijah virulence 22, 23 . Zanimivo je, da so geni za te beljakovine, pa tudi gen za oksidoreduktazo ( ORX1 ) 20, ki se nahaja v planti , nameščeni na kromosomu 14, enem od kromosomov Fol LS. Vsi ti geni se hranijo v sevih, ki povzročajo paradižnikovo veno, vendar v drugih sevih običajno niso prisotni 24 . Podatki o genomu so omogočili identifikacijo genov za tri dodatne majhne proteine, ki so bili izločeni s plantažo, na kromosomu 14, imenovani SIX5 , SIX6 in SIX7 (dopolnilna tabela 22) na podlagi predhodno pridobljenih podatkov o masni spektrometriji 20 . Skupaj je mogoče teh sedem genov uporabiti kot markerje za identifikacijo vsakega od treh superkontig (SC 22, 36 in 51), lokaliziranih na kromosomu 14 (dodatna tabela 23 in dodatna slika 15).

Glede na kombinirane eksperimentalne ugotovitve in računske dokaze smo predlagali, da bi lahko LS kromosom 14 odgovarjal za patogenost Fola proti paradižniku in da bi njegova mobilnost med sevi lahko pojasnila njegovo prisotnost v patogenih paradižnikove vedre, ki obsega več klonalnih linij, ki so polifiletne znotraj Fo vrsta kompleksna, vendar odsotnost v drugih vrstah 24 Da bi preizkusili te hipoteze, smo raziskovali, ali lahko kromosom 14 prenesemo in ali bi prenos preusmeril patogenost med različnimi sevi Fo , pri čemer smo kot markerje uporabili gene za proteine, ki jih locira planta, na kromosomu 14. Fol 007, sev, ki lahko povzroči paradižnikovo veno, je bil inkubiran z nepatogenim izolatom ( Fo -47) in dvema drugim sevom, ki sta patogena proti meloni ( Fom ) oziroma banani ( Foc ). Gen, ki daje odpornost proti zeocinu ( BLE ), je bil vstavljen blizu SIX1 kot marker za izbiro za prenos kromosoma 14 iz donorovega seva v Fo -47, Fom ali Foc . Sprejemljive seve smo transformirali z genom za odpornost na higromicin ( HYG ), naključno vstavljenim v genom; izbrani so bili trije neodvisni higromicin odporni transformanti na prejemni sev. Mikrokonidijo različnih sevov izoliramo in zmešamo v razmerju 1: 1 na ploščicah z agarji. Spore, ki so se na teh ploščah pojavile po 6–8 dneh inkubacije, so bile izbrane za odpornost tako na zeocin kot na higromicin. Dvojne kolonije, odporne na zdravila, so bile odkrite s Fom in Fo -47, vendar Foc kot prejemnik ni bil uporabljen s frekvenco približno 0, 1 do 10 na milijon spore (dodatna tabela 24).

Analize patogenosti so pokazale, da so dvojni odporni sevi na zdravila, ki izhajajo iz so-inkubacije Fol 007 s Fo -47, imenovanim Fo -47 +, pridobili sposobnost okužbe paradižnika do različnih stopenj (slika 4a, b). Nasprotno pa noben od dvojnih odpornih sevov na zdravila, ki izhajajo iz so-inkubiranja Fol 007 z Fomom, ni mogel okužiti paradižnika. Vsi sevi Fo -47 + so vsebovali velike dele Fol kromosoma 14, kar je razvidno s PCR amplifikacijo sedmih genskih markerjev (slika 4c, dopolnilna slika 15 in dodatne informacije F). Starševski sevi in ​​tudi sekvencirani sev Fol 4287 imata vsak različen kariotip. To nam je omogočilo, da smo s kromosomsko elektroforezo ugotovili, ali se je celoten kromosom 14 Fol 007 prenesel v seve Fo -47 + . Vsi sevi Fo -47 + so imeli isti kariotip kot Fo -47, razen prisotnosti enega ali dveh dodatnih majhnih kromosomov (slika 4d). Hromosom, prisoten v vseh sevih Fo -47 + (slika 4d, puščica številka 1), je bil potrjen kot kromosom 14 iz Fol 007 glede na njegovo velikost in južno hibridizacijo s pomočjo sonde SIX6 (slika 4e). Zanimivo je, da dva dvojna odporna na zdravila ( Fo -47 + 1C in Fo -47 + 2A na sliki 4a), ki sta povzročila najvišjo stopnjo bolezni (slika 4a, b), imata drugi dodatni kromosom, ki ustreza velikosti do najmanjšega kromosoma v sevu darovalca Fol 007 (slika 4d, puščica številka 2).

Image

a, rastline paradižnika, okužene s sevi Fol 007, Fo- 47 ali dvojno odpornimi na zdravila Fo -47 + (1A do 3C), pridobljene iz te starševske kombinacije, dva tedna po inokulaciji, kot je opisano za b . b, osem od devetih sevov Fo -47 +, ki izhajajo iz parjenja Fol 007 in Fo -47, kaže patogenost do paradižnika. Povprečna resnost bolezni pri sadikih paradižnikov je bila izmerjena 3 tedne po inokulaciji v poljubnih enotah (au). Celoten fenotip in obseg porjavelosti posod je bil ocenjen na lestvici od 0–4: 0, brez simptomov; 1, rahlo otekel in / ali upognjen hipokotil; 2, en ali dva rjava žilna snopa v hipokotilu; 3, vsaj dva rjava žilna snopa in izkrivljanje rasti (močno upogibanje stebla in asimetričen razvoj); 4, vsi žilni snopi so rjavi, rastline bodisi mrtve bodisi omamne in zakrnele. c, Prisotnost genov SIX in ORX1 v izolatih Fom , Fo- 47 in Fol ter v dvojnih odpornih na zdravila sevov, pridobljenih s sočasno inkubacijo Fol / Fom in Fol / Fo -47, ocenjeno s PCR na genomsko DNK. So-inkubacije smo izvedli z izolati, prikazanimi krepko. Raziskani so bili trije neodvisni transformanti Fom in Fo -47 z naključno vstavljenim genom za odpornost na higromicin (H1, H2, H3). d, sevi Fo -47 +, dobljeni iz sočasne inkubacije Fol 007 / Fo -47, imajo enak kariotip kot Fo- 47, plus en ali dva kromosoma iz Fol 007. Protoplasti iz Fol 4287, Fol 007 (z BLE na kromosomu 14 ), tri neodvisne HYG transformante fo -47 (pas Fo -47 H1, H2 in H3) in devet sevov Fo -47 + (pas 1A do 3C, številka 1, 2 ali 3, ki se nanašajo na HYG odporni transformator, iz katerega so dobljeni) smo naložili na CHEF (konturno stisnjeno homogeno električno polje) gel. Kot marker molekularne velikosti smo uporabili kromosome S. pombe . Puščici 1 in 2 kažeta na dodatne kromosome v sevih Fo -47 + glede na Fo -47. e, južni del gela CHEF, prikazan na d, hibridiziran s sondo SIX6 , kar kaže, da je kromosom 14 (puščica 1 v d ) prisoten v vseh sevih, razen Fo -47 (H1, H2 in H3).

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Da bi natančno ocenili, ali je bil dodatni genetski material, ki ni kromosom 14, morda prenesen iz Fol 007 v sevov Fo -47 +, smo razvili PCR temeljne snovi za pomnoževanje 29 kromosomskih specifičnih markerjev iz Fol007, ne pa za Fo-47 . Ti markerji (v povprečju po dva za vsak kromosom) so bili uporabljeni za testiranje sevov Fo- 47 + na prisotnost genomskih regij, pridobljenih iz Fol 007 (dopolnilne informacije F.4 in dopolnilna slika 16). Pokazalo se je, da imajo vsi sevi Fo -47 + označevalce kromosoma 14 (dopolnilna slika 17), ne pa tudi markerjev Fol 007, ki so nameščeni na katerem koli jedrnem kromosomu, kar potrjuje, da jedrni kromosomi niso bili preneseni. Zanimivo je, da sta oba seva Fo -47 + (1C in 2A), ki imata drugi majhen kromosom in sta povzročila več simptomov bolezni, pozitiven tudi za dodaten marker Fol 007 (dopolnilna slika 17), povezan z velikim podvojenim območjem LS v Fol 4287: ogrodje 18 (1, 3 Mb na kromosomu 3) in oder 21 (1, 0 Mb na kromosomu 6) (slika 2c). Prisotnost večine ali celotne sekvence odra 18/21 v sevih 1C in 2A je bila potrjena z dodatnimi devetimi pari primerov za genske markerje, raztresene po tem območju (podatki niso prikazani, glejte dopolnilne tabele 25a, b za sekvence prajmov) ( Slika 4d).

Skupaj sklepamo, da lahko patogenost sevov Fo -47 + za paradižnik posebej pripišemo pridobitvi Fol kromosoma 14, ki vsebuje vse znane gene za majhne proteine, ki jih tvori planta . Poleg tega lahko geni na drugih LS kromosomih še povečajo virulence, kar dokazujeta dva seva, ki vsebujeta dodatni LS kromosom iz Fol 007. V ozadju Fol 007 nismo našli dvojnega odpornega na zdravila seva z označenim kromosomom Fo -47 . Prav tako naključno označen transformant Fol 007 ni povzročil dvojnih kolonij, odpornih na zdravila, ko so inkubirali z Fo -47 (podatki niso prikazani). To kaže, da je prenos med sevi lahko omejen na določene kromosome, ki jih morda določijo različni dejavniki, vključno z velikostjo in vsebnostjo TE v kromosomu. Njihovo nagnjenost k prenosu podpira dejstvo, da se je najmanjši LS kromosom v Fol 007 premaknil na Fo -47, ne da bi bil v dveh od devetih primerov izbran za odpornost na zdravila.

Diskusija

Primerjava genomov Fusarium je pokazala izjemno genomsko organizacijo in dinamiko aseksualne vrste Fol . Ta patogen paradižnik vsebuje štiri edinstvene kromosome, ki predstavljajo več kot četrtino njegovega genoma. Značilnosti zaporedja genov v regijah LS kažejo na izrazit evolucijski izvor teh regij. Eksperimentalno smo dokazali prenos celotnih LS kromosomov s preprosto ko-inkubacijo med dvema sicer gensko izoliranima pripadnikoma Fo . Relativna enostavnost, s katero nastajajo novi paradižnikovi patogeni genotipi, podpira hipotezo, da je do takega prenosa med sevi Fo morda prišlo v naravi 24 in neposredno vpliva na naše razumevanje narave glivičnih patogenov. Čeprav je bil horizontalni prenos genov dokumentiran pri drugih evkariotih, vključno z metazoji 25 . Vendar pa predhodno niso poročali o spontanem horizontalnem prenosu tako velikega dela genoma in neposrednem prikazu povezanega prenosa gostiteljsko specifične patogenosti.

Vodoravni prenos faktorjev specifičnosti gostitelja med sicer oddaljenimi in gensko izoliranimi območji Fo lahko razloži očiten polifilenski izvor gostiteljske specializacije 26 in hiter pojav novih patogenih rodov v sicer izrazitih in nezdružljivih genetskih okoliščinah 27 . Regije Fol LS so obogatene za gene, povezane z interakcijo gostitelj-patogen. Z mobilizacijo teh kromosomov bi lahko v enem samem primeru prenesti celoten niz genov, potrebnih za združljivost gostitelja, v novo genetsko linijo. Če bi se pri prejemnikovi liniji okoljska prilagoditev razlikovala od darovalke, bi prenos lahko povečal splošno pojavnost bolezni pri gostitelju z uvedbo patogenosti v genetskem ozadju, ki je predhodno prilagojeno lokalnemu okolju. Takšno poznavanje mehanizmov, na katerih temelji hitro prilagajanje patogenov, bo vplivalo na razvoj strategij za obvladovanje bolezni v kmetijskih okoljih.

Povzetek metod

Generacija sekvenciranja in sestavljanja genomov

Celotni sklopi strelnih pušk (GGS) Fv (8 × pokritost) in Fol (6, 8 × pokritost) so bili ustvarjeni z uporabo tehnologije Sanger sekvenciranja in sestavljeni s pomočjo Arachne 6 . Fizične karte so nastale s pritrditvijo sklopov na Fv genetsko povezovalno karto 7 in na Fol optično karto.

Določanje hierarhične sinteze

Sidra za lokalno poravnavo so bila zaznana s pomočjo PatternHunterja (1 × 10 10 ) (ref. 28). Neprekinjeni nizi sidra z ohranjenim vrstnim redom in orientacijo so bili povezani v 10 kb razdalji in filtrirani, da se noben blok ne prekriva z drugim blokom za več kot 90% njegove dolžine.

Identifikacija ponavljajočih se sekvenc

Ponavljanja smo zaznali z iskanjem zaporedja genom proti sebi s CrossMatchom (≥ 200 bp in ≥ 60% podobnost zaporedja). Celoten TE so bili označeni z uporabo kombinacije računskih napovedi in ročnega pregleda. Z uporabo Alignerja 29 so bile ugotovljene velike segmentarne podvojenosti.

Karakterizacija proteomov

Ortologni geni so bili določeni na podlagi BLASTP in sintetičnih sintetičnih poravnav (SI). Za primerjavo sorodnosti beljakovin med tremi genomi smo uporabili teste razmerja blast 30 . Za izračun frekvenc uporabe kodona je bilo uporabljeno orodje EMBOSS 'cusp' (//emboss.sourceforge.net/). Izrazi za gensko ontologijo so bili dodeljeni s programsko opremo Blast2GO 31 (BLASTP 1 × 10 20 ) in testirani za obogatitev s Fisherjevim natančnim testom, popravljenim za večkratno testiranje 32 . Za karakterizacijo genskih družin 33, 34 smo uporabili kombinacijo iskanja homologije in ročnega pregleda. Po odstranitvi trans-membranskih / mitohondrijskih proteinov na osnovi TMHMM (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) smo identificirali s pomočjo SignalP (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), Napovedi Phobiusa (razen v prvih 50 aminokislinah) in TargetP (ocena 1 ali 2 RC). Majhne beljakovine, ki jih izločajo cistein, so bile opredeljene kot izločeni proteini, ki so dolgi manj kot 200 aminokislin in vsebujejo vsaj 4% cisteinskih ostankov. GPI (glikozil fosfatidil inozitol) -anchor proteini so bili identificirani s signalom pritrditve GPI-sidra med predvidenimi izločenimi proteini z uporabo skripte PERL po meri.

Pridružitve

Vloge podatkov

Vsa odčitavanja zaporedja lahko prenesete iz skladišča sledenja NCBI. Skupščine Fv in Fol so bile deponirane pri GenBank v okviru projektov pristopa AAIM02000000 in AAXH01000000. Podrobne informacije so dostopne na primerjalnem spletnem mestu Broad Fusarium: //www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_group.3/MultiHome.html.

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Ta datoteka vsebuje dodatne informacije o (A) zaporedju, sestavljanju in kartiranju genoma; (B) Opomba; (C) lastnosti, ki so skupne genomom Fusarium ; (D) genske skupine sekundarnih presnov; (E) Značilnosti kromosomov Fusarium oxysporum LS in (F) prenos LS kromosomov med sevi.

  2. 2

    Dopolnilne številke

    Ta datoteka vsebuje dodatne slike S1-S20 z legendami.

  3. 3.

    Dopolnilne tabele

    Ta datoteka vsebuje dodatne tabele S1-S25.

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.