Značilna interakcija ceacam5 s cd8α in cd1d pri črevesni homeostazi | imunologija sluznice

Značilna interakcija ceacam5 s cd8α in cd1d pri črevesni homeostazi | imunologija sluznice

Anonim

Predmeti

  • Celice, ki predstavljajo antigen
  • CD8-pozitivne T celice
  • Imunologija sluznice

Izvleček

Normalne črevesne epitelijske celice (IEC) bi lahko delovale kot nepoklicne celice, ki predstavljajo antigen, selektivno aktivirajo CD8 + -suppresorske T celice. Površinski glikoprotein epitelijskih celic gp180, prepoznan po monoklonskih protitelesa B9 in L12, je bil ugotovljen kot kritičen v tem postopku. Čiščenje in analiza zaporedja mAb B9 reaktivnega materiala je pokazala, da je s CEACAM5 homologna zaporedje aminokislin. Dokazujemo, da ima CEACAM5 lastnosti, ki so pripisane gp180, na primer vezavo CD8α in aktiviranje Lck, povezanega s CD8. CEACAM5 je edini član CEACAM-a, ki komunicira s CD1d prek domene B3. Njegova N domena (prepozna jo B9) je potrebna za vezavo CD8α. Odstranitev glikoziliranih ostankov N-domene zmanjša prepoznavanje B9, afiniteto vezave CD8α in aktiviranje LcK. Zato so konformacijske spremembe na mestu glikozilacije CEACAM5 ključne za njegovo interakcijo s CD8α. CE8AM-aktivirane CD8 + T celice pridobijo sposobnost zatiranja proliferacije celic CD4 + T in vitro v prisotnosti interlevkina (IL) -15 ali IL-7. Ponujamo nova spoznanja o vlogi CEACAM5 in opredeljujemo njegove posebne imunoregulacijske lastnosti med CEACAM, izraženimi na IEC. Predlagamo, da edinstven nabor interakcij med CEACAM5, CD1d in CD8 postane CD1d molekul bolj podoben razredu I, kar olajša predstavitev antigena in aktivira regulacijske T celice CD8 + -supresorja.

UVOD

Narava imunskega odziva v črevesju lahko zahteva bodisi imunosupresijo bodisi nadzorovano vnetje. Zatiralno stanje narekuje več dejavnikov, vključno z regulativnimi T (Treg) celicami, ne-T celicami in edinstvenimi celicami, ki predstavljajo antigen. Številni laboratoriji, pa tudi naš, so opisali vlogo črevesnih epitelijskih celic (IEC) kot nepoklicne celice, ki predstavljajo antigen. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 CD8 + Treg celice lahko IEC aktivirajo skozi kompleks, ki ga tvorijo neklasična molekula I, CD1d in gp180 na IEC. Poleg tega smo pred kratkim dokazali, da so CD8 + T-celične linije, ki izvirajo iz limfocitov lamina propria kronoloških bolnikov, okvarjene pri zatiranju. V tem scenariju je bilo za določitev in zlasti za vzdrževanje dolgoročnih CD8 + T-celičnih kultur ključno dodajanje citokinov interlevkina (IL) -15 ali IL-7, ki so povzročili IEC. 8 Označili smo gp180 kot površinski glikoprotein, ki ga prepoznata dva anti-epitelijska celica mAbs, B9 in L12. Dokazano je, da se gp180, prečiščen z afiniteto, veže na CD1d in CD8α in poveča aktivnost Lck kinaze, povezano s CD8. Nato CD1d postane molekuli podobne razredu I, z izboljšano vezavo CD1d na T-celični receptor in vezavo gp180 na CD8α. V IEC: T-celičnih poskusih s sokulturo mAbs B9 in L12 blokirajo selektivno proliferacijo CD8 + T celic in zavirajo sposobnost IEC-a, da fosforilirajo in aktivirajo Lck. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 Poleg tega smo z uporabo mAb B9 pokazali, da se je izražanje gp180 znatno zmanjšalo v ne vnetih tkivih, ki izvirajo iz bolnikov z vnetno črevesno boleznijo (IBD). Ta napaka je bila v korelaciji z nezmožnostjo IEC IBD, da aktivirajo CD8 + Treg celice. 20

Družina karcinoembrionskih antigenov (CEA) spada v super družino imunoglobulinskega (Ig) gena, sestavljeno iz podskupine CEACAM in glikoproteina, specifičnega za nosečnost. Medtem ko se za nosečnost specifični glikoprotein izloča, so proteini poddružine CEACAM močno glikozilirani celični površinski proteini. So ali transmembranski ali glikofosfatidil-inozitol (GPI). Analiza aminokislinskih zaporedij razkriva jasno domensko organizacijo med družinskimi člani. Pri članih družine CEA opazimo dve vrsti Ig domen: N-terminalno domeno, ki je homologna s spremenljivo domeno Ig (podobna IgV) in 0–6 C-terminalna domena, ki sta homologna konstantni domeni Ig (IgC- všeč). IgC-podobna domena je lahko tipa A ali tipa B. CEA se izraža v stolpnih IEC in pehastih celicah debelega črevesa, v sluznicah vratnih celic in piloričnih sluznic želodca, v skvamoznih epitelijskih celicah jezika, požiralnika in materničnega vratu in v kanalu trebušne slinavke. V različnih poročilih je opisana vloga članov družine CEA pri adheziji med celico in celico, ki vključuje homotipske in heterotipske interakcije prek njihovih N-terminalnih domen. Opisanih je bilo več članov, ki delujejo kot senzorji patogenov, kar nakazuje na možno vlogo CEA v presledku gostitelj-patogen. 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31

Zdaj poročamo, da afiniteto prečiščen gp180 prikazuje homolognost zaporedja z N-terminalno domeno CEACAM5 in dokazujemo, da imata tako gp180 kot CEACAM5 skupne vezavne in funkcionalne lastnosti. Nadalje razkrivamo, da ima CEACAM5 zelo specifično pozitivno imunoregulacijsko funkcijo v primerjavi z ostalimi štirimi družinskimi člani CEACAM, izraženimi v IEC. Na koncu ločimo edinstven nabor interakcij med CEACAM5 / CD1d in CEACAM5 / CD8 in prvič dajemo dokaze, da CEACAM5 povzroča celice CD8 + T z močnimi funkcijami supresorja.

REZULTATI

CEACAM5 deli homologijo z gp180 in jo prepozna B9 mAb

Za določitev specifičnega ciljnega proteina mAb B9 smo gp180 očistili z imuno-afiniteto z uporabo mAb B9 in ga podvrgli sekvenci amino amino z Edmanovo razgradnjo. Prvih 25 aminokislin je pokazalo 100-odstotno homolognost zaporedja s CEACAM5 (slika 1a). Drugi člani družine CEACAM niso pokazali podobnosti z pridobljenim zaporedjem gp180 (podatki niso prikazani). Ustreznost molekulskih mas in N-končnih aminokislinskih sekvenc gp180 in CEACAM5 močno podpira trditev, da so ti proteini enaki.

Image

CEACAM5 deli homologijo z gp180 in jo prepozna B9 mAb. ( a ) Amino-terminalno zaporedje specifičnega ciljnega proteina mAb B9, gp180 in CEACAM5. Prvih 25 aminokislin je pokazalo 100% homolognost zaporedja s CEACAM5. ( b ) Imunobloting za CEACAM5 v lizatih, pridobljenih iz HT29, pa tudi iz celic FO-1 in 293T, ki so bile okužene s CEACAM5. Monoklonalna protitelesa B9 in Col-1 so bila uporabljena za Western blot. Kot negativno kontrolo smo uporabili ne-okužene celice FO-1 in 293T. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Glede na homolognost zaporedja N-terminalov CEACAM5 smo spraševali, ali je ta član družine CEACAM izrazil epitop, prepoznan z mAb B9. Prekomerno smo izrazili CEACAM5 v celicah 293T in FO-1 in ovrednotili ekspresijo beljakovin z Western blottingom. Celice HT29 so bile uporabljene kot pozitiven nadzor, saj te celice izražajo endogeni CEACAM5. Naši rezultati jasno kažejo, da CEACAM5 prepoznata B9 in Col-1 (anti-CEA, ki prepozna domene A in B) mAbs (slika 1b).

Identifikacija epitopov B9 na CEACAM5

Poravnava CEACAM5 s CEACAM1 ali CEACAM6 kaže raznolikost v aminokislinskem zaporedju v območju med ostanki 42 in 46 domene N. Zato smo ustvarili mutante CEACAM5, ki nosijo brisanje te regije (N 42 RQII) ali enotočkovno mutacijo v bližini tega območja (K 35 A), da bi določili epitop CEACAM5, prepoznan z B9. Analiza protočne citometrije CEACAM5, ki izraža CHO celice, je pokazala, da je velik odstotek celic pozitivnih na T84.66, mAb, ki prepoznava A in B domene CEACAM5, pozitiven tudi na B9. Čeprav mutant K 35 A ni vplival na reaktivnost B9 s celicami, je N 42 RQII močno zmanjšal obarvanje z B9 (slika 2a). Zanimivo je, da se z izražanjem mutanta N70, 81A CEACAM5, ki preprečuje glikozilacijo N-domene, bistveno zmanjša obarvanje B9, kar potrjuje naše prejšnje podatke, da zdravljenje gp180 z N-glikanazo povzroči izgubo epitopa, prepoznanega z mAb B9 9 ( Slika 2a).

Image

B9 prepozna različne CEACAM, izražene na črevesnih epitelijskih celicah, vendar se specifično veže na edinstveno regijo v domeni N CEACAM5. ( a ) Citofluorimetrični profili CHO celic, ki so bili okuženi z divjim tipom CEACAM5, mutantom z delecijo N 42 RQII ter točkovnimi mutanti K35A in N70, 81 A in dvojno obarvani z mAb T84.66 in mAb B9. Reaktivnost B9 je bila zmanjšana s celicami, ki izražajo mutant za delecijo in mutant brez sladkorja CEACAM5. ( b ) Cito-fluorimetrični profili CHO celic, ki izražajo CEACAM5 ali CEACAM1-4L, CEACAM6 in CEACAM8, so označeni z B9 ali B18 mAbs. B9 lahko prepozna vse štiri člane CEACAM-a. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

B9 mAb prepozna ostale člane družine CEACAM

Za nadaljnjo oceno vezave med CEACAM5 in B9 mAb so CHO celice, ki so prekomerno pritiskale na štiri različne družinske člane CEACAM (CEACAM1-4L, 5, 6 in 8) inkubirali z mAbs B9 in B18 (anti-CEA, ki prepozna epitope v C- terminalna domena) in analiziramo s protočno citometrijo. Dejansko se je CEACAM5 na celice CHO vezal na B9 mAb in potrdil njihovo interakcijo (slika 2b). Ti podatki kažejo, da CEACAM5 ima domeno, ki je podobna ali identična epitopu B9. Poleg tega je B9 mAb prepoznal CEACAM6, CEACAM1-4L in CEACAM8, ne pa tudi neprekužene celične linije CHO (slika 2b). Tako ima več članov družine CEACAM skupno domeno, podobno epitopu B9, v svojem N-terminalnem območju in bi verjetno imeli imunosupresivno funkcijo CEACAM5.

CEACAM5 se na domeno B3 veže na CD1d

Da bi ocenili, kateri član družine CEACAM ima lastnosti vezave na CD1d, smo v 293T celicah izrazili različne CEACAM in CD1d in izvedli so-imunoprecipitacijske poskuse z uporabo protitelesa D5 proti CD1d. Naši rezultati kažejo, da samo CEACAM5, ne pa tudi CEACAM1 ali CEACAM6, sodelujeta s CD1d, razkritim z Western blotting analizo z uporabo B9 mAb (slika 3a in glejte dodatno spletno sliko S1a). Za potrditev vezave CEACAM5 / CD1d smo dodatno izvedli eksperimente obratne ko-imunoprecipitacije z uporabo B9 mAb. Podatki, prikazani na sliki 3b in dodatni sliki S1b na spletu, potrjujejo, da samo CEACAM5 deluje s CD1d. Vsi člani družine CEACAM vsebujejo zunajcelične N-terminalne IgV podobne in različne C-terminalne IgC podobne domene, ki so označene kot domene tipa A ali tipa B. S primerjavo zaporedij CEACAM1, 5 in 6 smo ugotovili omejeno homologijo znotraj družin članov CEACAM na področjih A2 in B3 (B1 za CEACAM1 in CEACAM6). Za nadaljnjo opredelitev, katera domena CEACAM5 je vključena v interakcijo s CD1d, smo ustvarili različne deletacijske mutante CEACAM5 (slika 4a) in izvedli eksperimente sokomunoprecipitacije, kot je opisano zgoraj. Niti brisanje N-terminalne regije niti domene A2 ne prispeva k interakciji med CEACAM5 in CD1d (slika 4b). V nasprotju s tem so nam zaporedna C-terminalna odseka vsake domene omogočila, da ugotovimo, da je izbris domene B3 izbrisal sposobnost CEACAM5, da se veže na CD1d (Slika 4c in glej dodatno spletno S2 na spletu). Nato smo izvedli zaporedno brisanje znotraj domene B3 in ugotovili, da je interakcija med CD1d in CEACAM5 odvisna od celovitosti fragmentov 2–5 domene B3. Izbris te regije je v celoti razveljavil vezanje CEACAM5-CD1d (slika 4c in glej dopolnilno sliko S2).

Image

CEACAM5, vendar ne CEACAM1 ali CEACAM6, se veže na CD1d. 293T celice so bile transfektirane samo s pcDNA3.1-IRES-CD1d same ali skupaj s CEACAM1, CEACAM5 ali CEACAM6. Celični lizat smo sočasno imunoprecipitirali z mišjim IgG2b anti-CD1d (D5) ali z mišjim protitelesom IgG1 anti-gp180 (B9). Western blot (WB) smo izvedli z Col-1 in D5 mAbs. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse. IP, imunoprecipitacija.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Image

Domena B3 CEACAM5 je vključena v njegovo interakcijo s CD1d. 293T celice smo transficirali z ekspresijskimi vektorji pCDNA3.1-IRES, ki izražajo CD1d in divji tip (WT) ali okrnjen CEACAM5. Celični lizat transfektantov je imunoprecipitiran (IP) z mišjim IgG2b anti-CD1d (D5). Western blot (WB) smo nato izvedli s Col-1 in D5 mAbs. ( a ) Shematska predstavitev izbrisov domene N, domene A2 in odsekov C-terminalov. ( b ) WT in CEACAM5 z izbrisom N domene (N) so-imunoprecipitat s CD1d. WT in CEACAM5 z brisanjem domene A2 (A2) sočasno imunoprecipitat s CD1d. ( c ) CEACAM5 z zaporednimi C-terminalnimi odseki vsake domene ne sočasno imunoprecipitira s CD1d. CEACAM5 z izbrisom fragmenta 1 ko-imunoprecipitata domene B3 s CD1d. Z nadaljnjim izbrisom domene B3, CEACAM5 ne uspe soimunoprecipitirati s CD1d. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

CEACAM5 se veže na verige CD8α in inducira fosforilacijo CD8-povezane kinaze Lck

CEACAM5 obstaja kot GPI zasidran glikoprotein na površini IEC. Molekulo je torej mogoče odstraniti s cepitvijo sidra z encimom fosfoinozid fosfolipazo C (PIPLC), kot je opisano prej. 9 CEACAM5, ki se sprosti iz okuženih 293T celic z zdravljenjem s PIPLC, je bil uporabljen v vrsti študij absorpcije. Najprej smo ocenili z Western blottingom ravni CEACAM5 v supernatantih 293T celic, ki so bile transficirane s CEACAM5 ali praznim kontrolnim vektorjem in obdelane s PIPLC (Sup1). Celice HT29 so bile uporabljene kot pozitivna kontrola. Nato smo celicno linijo melanoma FO-1 in mišične hibridome T celice, ki izražajo človeški CD4 (3G4) ali človeški CD8α (3G8), so-gojili s Sup1, količino preostalega CEACAM5 pa smo ovrednotili v supernatantih (Sup2) z uporabo Protitelo Col-1. To bo pokazalo, koliko CEACAM5 je absorbiral CD4 ali CD8α, izražen na T celicah. Naši rezultati kažejo, da se je raven CEACAM5 v Sup2 znižala ob inkubiranju s celicami 3G8, kar kaže na to, da je CEACAM5, prisoten v Sup1, absorbiral CD8α na teh T celicah (slika 5a).

Image

CEACAM5 veže CD8α in inducira fosforilacijo LcK, povezanega s CD8. ( a ) 3G4 in 3G8 celice smo inkubirali s fosfoinozid fosfolipazo C (PIPLC) supernatanti iz CEACAM5 transfektantov, vektorsko nadzorovanimi 293 T celicami ali ( b ) celične linije T84 črevesnih epitelijskih celic. Kot negativni nadzor smo uporabili celice FO-1. Absorbirani ali nesorbirani supernatanti so bili podvrženi imuno blotingu z uporabo m-AC Col-1 ali B9. 3G8, vendar ne 3G4, so lahko absorbirali CEACAM5. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse. ( c ) 3G celice smo inkubirali s prečiščenim CEACAM5 v različnih časovnih točkah in jih podvrgli imuno blotingu za fosfoLcK mAb. Pri 15 'CEACAM5 sproži fosforilacijo LcK. Podatki so reprezentativni za tri neodvisne poskuse. ( d ) Analiza pretočne citometrije obarvanja p-Lck v človeških perifernih celicah CD8 + T in CD4 + T celic, stimuliranih s peptidom, prečiščenim Sup1, mAb CD8, in CEACAM5 za različne časovne točke. H 2 O 2 predstavlja pozitiven nadzor. Podatki so reprezentativni za pet neodvisnih poskusov.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Poleg tega smo izvedli podobne poskuse s človeškimi celicami IEC T84, ki na svoji površini izražajo več CEACAM-ov. Absorpcijo CEACAM5 iz Sup1 bodisi s CD4 bodisi s CD8α smo določili z imunoblotiranjem z uporabo protiteles B9 in Col-1. Človeške CD8α, vendar ne CD4, ki izražajo hibridomske celice, so lahko absorbirale reaktivni material B9 (slika 5b). Zanimivo je, da so te ugotovitve skladne s funkcionalnimi lastnostmi, ki so bile prej pripisane gp180. Da bi ugotovili, ali ima vezava na CD8α funkcionalni pomen, smo ocenili sposobnost CEACAM5, da inducira fosforilacijo CD8-povezane kinaze Lck. Z uporabo Western blot analize smo opazili povečanje vrednosti p-Lck 15 minut po obdelavi celic 3G8 s prečiščenim CEACAM5 (slika 5c in glej dodatno sliko S3a). Nadalje smo potrdili aktivacijo Lck s pretočno citometrijo v sveže izoliranih celicah CD8 + T periferne krvi. Fosforilacija Lck se je zgodila na časovno odvisen način po obdelavi celic CD8 + T s prečiščenim peptidom CEACAM5, OKT8 (anti-CD8 mAb) ali Sup1 iz T84 celic s PIPLC (slika 5d). Nasprotno, celice CD4 + T, stimulirane s prečiščenim CEACAM5 ali OKT8, niso pokazale povečanja fosforilacije LcK. Poleg tega smo ocenili, ali CEACAM5 inducira fosforilacijo ZAP70, s CD3ζ verigo povezano proteinsko kinazo. Podobno kot aktivacija LcK, je očiščena fosforilacija ZAP70 povzročila prečiščena CEACAM5 na časovno odvisen način (glejte dodatno sliko S3b, c). Ti podatki kažejo, da se CEACAM5 ne le specifično veže na CD8α, ampak podobno kot gp180 povzroči fosforilacijo in aktiviranje CD-ja, povezanega s CD8.

Interakcija CEACAM5-CD8α je odvisna od določenega mesta glikozilacije znotraj domene N

Za določitev vezivne afinitete med divjim tipom (WT) CEACAM5 in CD8α smo uporabili sistem Biacore, kjer je ena molekula (topni ligand CD8α ali kontrolni CD4) imobilizirana na matriki dekstrana in domnevni analit v raztopini (CEACAM5 WT ali mutanti ) se prenese čez površino (slika 6a in glej dopolnilno sliko S4). Popolna kinetična analiza vezave WT CEACAM5 / CD8α je pokazala, da je bila afiniteta enakovredna interakciji med CD8α in glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) I (slika 6b). 32, 33 Izvedena afinitetna konstanta je bila ocenjena na 2, 20E-08 M in izračunana z uporabo naslednjih konstant hitrosti in izklopa, 2, 60E + 04 M-1s-1 ( K ON ) in 5, 60E-04 s- 1 ( K OFF ) (slika 6d). Povezavo CEACAM5 na CD8α smo opazili z manj kot 50 n M očiščenega proteina CEACAM5. Med WT CEACAM5 in rekombinantnim beljakovinami CD4 ni bilo zaznane vezave (slika 6c). Da bi ocenili, ali je brisanje ostankov N42 na I46 v N-terminalni domeni CEACAM5 vplivalo na vezivno afiniteto, smo nato preučili interakcijo med N 42 RQII in CD8α. Analiza Biacore je pokazala pomembno in podobno znižanje KD N 42 RQII v primerjavi z WT CEACAM5 vezavo na CD8α ( K D = 1, 70E-08 M; K ON = 9E + 04 M-1s-1; K OFF = 1, 5 E-03 s-1) (slika 6d). Nato smo ocenili afiniteto medsebojnega delovanja med različnimi mutanti CEACAM5 na CD8α. Zanimivo je, da je afiniteta vezave mutanta N70, 81A CEACAM5 na CD8α ( K D = 1, 60E-05 M; K ON = 2, 90E + 02 M-1s-1) in K OFF = 4, 70E-03 s-1) v primerjavi z WT CEACAM5 se je zdelo zelo nizko, medtem ko je imel mutant K35A primerljivo vrednost K D kot N 42 RQII in WT CEACAM5 ( K D = 1, 50E-07 M; K ON = 1, 50E + 04 M-1s-1, in K OFF = 2, 30E-03 s-1) (slika 6d). Ti rezultati kažejo, da izguba začetne glikozilacije CEACAM5 močno vpliva na njegovo konformacijsko strukturo, kar ima za posledico zmanjšanje afinitete med CEACAM5 in CD8α.

Image

Odstranitev sladkornega mostu N-domene zmanjšuje afiniteto vezave CEACAM5-CD8α. ( a ) Shematski prikaz mutantov N-domene CEACAM5. ( b ) Vezava topnega divjega tipa CEACAM5 (WT) na imobiliziranega peptida CD8α in ( c ) divjega tipa CEACAM5 na imobiliziranega rekombinantnega peptida CD4. ( d ) vrednosti KD vezave WT CEACAM5, N 42 RQII, K35A in N70, 81 A na imobiliziran CD8α peptid.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

Poleg tega smo opravili analizo Western blottinga z mutanti N70, 81A CEACAM5 in ugotovili zmanjšanje fosforilacije v primerjavi z WT CEACAM5 (slika 5). Da bi dokazali, da na CEACAM5 obstaja delno prekrivajoče se vezivno mesto za B9 mAb in CD8α, smo izvedli tekmovalni test s predhodnim mešanjem CEACAM5 peptida z B9 mAb in zaporedoma dodajanje zmesi na CD8α na čipu. Po pričakovanjih ni bilo opaziti vezave, ki bi nakazovala, da B9 mAb blokira interakcije CEACAM5 / CD8α (glej dodatno sliko S5).

CE8AM-aktivirane CD8 + T celice pridobijo zaviralne funkcije

IEC so opisali, da aktivirajo periferne celice CD8 + T, ki postanejo močne celice supresorja. 12 Poleg tega so celice lamina propria CD8 + T pri bolnikih s Crohnovo boleznijo pokazale zmanjšano zaviralno aktivnost v primerjavi z zdravimi kontrolami. 8 Za proučevanje funkcije perifernih celic CD8 + T, aktiviranih s CEACAM5, smo najprej gojili sveže izolirane človeške CD8 + T celice v prisotnosti same CEACAM5 ali v kombinaciji z IL-15 ali IL-7. Prejšnje raziskave z uporabo različnih kombinacij citokinov so pokazale, da sta IL-7 in / ali IL-15 kritično pomembna za razvoj dolgoročnih linij v IEC: T-celičnih sokulturah. 8 Najprej smo ocenili izražanje grancima B v CD8 + T celicah, gojenih 72 ur v prisotnosti CEACAM5. Granzima B ni bilo mogoče zaznati v teh pogojih, kar kaže na to, da celice CD8 + T, aktivirane s CEACAM5, niso citotoksične T celice (podatki niso prikazani). Nato smo izvedli supresijske teste z oceno sposobnosti stimuliranih celic CD8 + T, da zatirajo proliferacijo CD4 + T celic. Kot je prikazano na sliki 7, so celice CD8 + T, predhodno inkubirane s CEACAM5, skupaj z IL-15 močno zavirale proliferacijo celic CD4 + T v enaki meri kot celice CD8 + T, zdravljene s protitelesi proti CD3 / CD28. Kombinacija CEACAM5 in IL-7 je povzročila podobno, vendar nižjo zatiranje CD4 + T-celic v primerjavi s celicami CD8 + T, ki so bile predhodno inkubirane z IL-15 (glejte dodatno sliko S6).

Image

Supresijska aktivnost CD8 + T celic, aktiviranih s CEACAM5. Širjenje karboksifluorescein sukcinimidil estra (CFSE), označeno s celicami CD4 + T v prisotnosti kroglic, ki delujejo na CD3 / CD28, celice CD8 + T, celice CD8 + T, stimulirane s CD3 / CD28, CEACAM5 +/− interlevkin 15 (IL15) -stimulirane celice CD8 + T in CD8 + T celice, ki jih stimulira OKT8 +/− IL15. Podatki so reprezentativni za štiri neodvisne poskuse.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

DISKUSIJA

Naše prejšnje študije so bile osredotočene na novo vlogo IEC kot celic, ki predstavljajo antigen. Določili smo, da lahko IEC sprejmejo topne antigene in jih predstavijo T celicam. V normalnem stanju takšna predstavitev povzroči selektivno aktiviranje CD8 + -suppresorskih T celic. To interakcijo smo opredelili tako, da smo identificirali dve molekuli, izraženi z normalnimi IEC, ki se na te Treg celice vežejo na T-celični receptor in na molekule CD8, CD1d in gp180. Izdelali smo tudi monoklonsko protitelo, ki specifično prepozna gp180. Ugotovili smo, da je bil ta mAb specifičen za epitelijske celice; zaviral je IEC-inducirano širjenje CD8 + T-celic in blokiral aktiviranje CD-ja, povezanega s CD8. Ta pristop je privedel do identifikacije molekul, ki sodelujejo v interakcijah IEC: T-celice, natančneje CD8 + T celice. Izkazalo se je, da je očiščen gp180 pomemben pri aktiviranju Lck prek vezave na CD8α in CD1d. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20

CEACAM5 je onkofetalni antigen, ki je bil prvotno odkrit kot molekula površinske celice, čigar ravni tkiva in krvi so pozitivno povezane s kolorektalnim rakom. Pokazalo se je, da vsi člani družine delujejo, vsaj in vitro , kot homotipske in heterotipske medcelične adhezijske molekule. Pokazalo se je, da sprememba v izražanju dveh članov, zasidranih s GPI, CEACAM5 in CEACAM6, zavira diferenciacijo in anoikis, moti polarizacijo celic in strukturo tkiv, učinke, ki v celoti povečujejo tumorigenezo. Na drugi strani CEACAM1, zasidran s transmembrano, nima nobene od teh lastnosti, vendar ima tumorsko-supresiven in angiogenski učinek. CEACAM1 je evolucijsko ohranjen, izražen je v mnogih tkivih odraslih in v glavnem sodeluje pri modulaciji delovanja T-celic na transport žolčne kisline. Člani družine CEA, zasidrani s GPI, so se razvili tik pred sevanjem primatov in edine funkcije, ki so jim bile dodeljene, razen medcelične adhezije, vključujejo vezavo njihovih sladkorjev na bakterije in selektine, kar olajša vezavo nevtrofilcev na vaskularni endotel (last, ki si ga deli CEACAM1 ). 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 Pred kratkim je CEACAM6 predlagan kot receptor za pilije tipa 1, izražene s adhezivno invazivno ešerihijo coli (AIEC), in njene nenormalne Izraz, opažen pri bolnikih s Crohnovo boleznijo, je povezan z večjo kolonizacijo in vnetjem, ki ga povzroča AIEC. 34 Prejšnje študije iz našega laboratorija so opisale regulativno / supresorsko populacijo CD8 + T-celic, CD8 + CD28 - CD103 + populacijo, ki se po interakciji s kompleksom, podobnim MHC razreda I, na oligoklonalni ekspanziji. bazolateralna površina epitelijske celice. 35

V tej raziskavi smo pokazali, da gp180 deli homologijo s CEACAM5. Najprej smo potrdili, da imata CEACAM5 in gp180 isto zaporedje aminokislin in da je B9 mAb sposoben prepoznati CEACAM5. Pokazali smo, da se CEACAM5 veže na CD8α in inducira Lck fosforilacijo. Poleg tega smo pokazali, da je med člani družine CEACAM CEACAM5 edini, ki komunicira s CD1d. Potrdili smo, da CEACAM5 sodeluje s CD1d prek domene B3 in da je sladkorni most med ostanki 70 in 81, ki je prvo zelo ohranjeno mesto glikozilacije znotraj N domene, vpleteno v interakcije protein-protein, ključnega pomena za vezanje CEACAM5 / CD8 in CD8 aktivacija kinaze Lck. 28 Analiza afinitete za beljakovine in beljakovine je potrdila, da mutant N70, 81A močno vpliva na vezavo CEACAM5 / CD8. Zato je glikozilacija domene N CEACAM5 ključnega pomena za njeno interakcijo s CD8α. Poleg tega smo dokazali, da imata B9 mAb in CD8α s konkurenčnimi poskusi afiniteto do podobnega mesta vezave na CEACAM5. Te ugotovitve potrjujejo prejšnja opažanja in potrjujejo, da B9 mAb blokira indukcijo celic CD8 + Treg.

Od njegove identifikacije Gold in Freeman leta 1965 je funkcionalni pomen CEACAM5 in njegova homologija za druge člane poddružine CEA v normalnih tkivih slabo razumljen. Pokazalo se je, da lahko povezavo bakterij na epitelijske celice olajšajo strukture sladkorja, ki so prisotne na CEACAM5 in CEACAM6. Poleg tega je nenormalno izražanje CEACAM6 pri bolnikih s CD povezalo z večjo kolonizacijo bakterij in povečanim vnetjem, ki ga posredujejo bakterije AIEC. 34 Tu smo prvič prikazali novo biokemično in funkcionalno aktivnost, ki jo je posredoval CEACAM5. Dokazali smo, da se CEACAM5 lahko veže tako na CD8α kot na CD1d in s tem soaktivira celice CD8 + T. Možno je, da imajo neklasične molekule razreda I podobne lastnosti, kjer se zapletejo z dodatno molekulo, da bi si naredile bolj podobne molekule klasičnega razreda I ali razreda II.

Pri raku debelega črevesa sta CEACAM5 in CEACAM6 disregulirana in prekomerno izražena. 24, 25 Prav tako je bilo opisano, da ima lahko CEACAM5, ki ga vežejo jetrne Kupfferjeve celice, vlogo pri krepitvi metastaz s stimulacijo in proizvodnjo različnih citokinov. 26 Drug član poddružine CEA, CEACAM1, se izraža na IEC in T celicah in dokazano zavira citolitično aktivnost črevesnih intraepitelnih limfocitov31, čeprav so poročali tudi o aktiviranju naravnih celic morilcev, ki jih je posredoval CEACAM1. 30

V naši raziskavi je prvič opisano, da imajo člani družine CEACAM različne imunoregulacijske funkcije kljub strukturni podobnosti. S CD1d deluje samo CEACAM5. Poleg tega se CEACAM5 na različne domene veže na CD1d in CD8α. Zato verjamemo, da se CEACAM5 nenehno širi od membranskega do medceličnega oddelka. Na splošno lahko CEACAM5 sodeluje pri zaužitju antigena, a bazolateralno tvori kompleks s CD1d in deluje kot molekula MHC razreda I. Predelava epitela antigena poteka na zelo polariziran način, pri čemer so apikalni antigeni razvrščeni in predstavljeni izključno bazolateralno. Verjamemo tudi, da bi ta edinstven nabor interakcij lahko olajšal predstavitev antigena s celicami CD1d na T in omogočil kasnejšo aktivacijo celic CD8 + Treg s potentnimi supresivnimi funkcijami (slika 8). Prej smo opisali, da imajo IEC, pridobljeni od bolnikov s KVČB, napako v izražanju CEACAM5 (gp180) zaradi očitne odpovedi aktiviranja celic CD8 + Treg. 37 Pred kratkim smo ustvarili CD8 + T-supresorske črte lamine propria v prisotnosti viklolizumaba monoklonskega protitelesa αCD3 skupaj z IL-15 in IL-7 in ugotovili smo, da zaviralne celice lamina propria CD8 + T pri bolnikih s Crohnovo boleznijo zmanjšana aktivnost supresorja. 8 Zanimivo je, da tukaj razširjamo te ugotovitve in dokazujemo, da CD8 + T celice, aktivirane s CEACAM5, pridobijo pomembne funkcije zatiranja. Zato bo razumevanje interakcij med celičnim receptorjem CEACAM5 / CD1d in CD8α / T v imunski sistem sluznice pri normalnih posameznikih omogočilo razvoj novih pristopov za spodbujanje indukcije supresivnih imunskih odzivov (pri Crohnovi bolezni) ali povečanje imunosti sluznice (ustno cepiva).

Image

Interakcije med CEACAM5 / CD1d in CEACAM5 / CD8α. Črevesne epitelijske celice izražajo CEACAM5 in CD1d na svoji površini. CEACAM5 (gp180) komunicira s CD1d prek domene B3. Odlomek 1 domene B3 ni potreben za njegovo interakcijo s CEACAM5. Sladkorni most v N domeni CEACAM5 je ključnega pomena za njegovo vezavo na CD8α in za aktiviranje CD8-povezanega LcK. CE8AM-aktivirane CD8 + T celice pridobijo zaviralne funkcije in zmanjšajo širjenje celic CD4 + T.

Slika v polni velikosti

  • Prenesite diapozitiv PowerPoint

METODE

Čiščenje in zaporedje gp180

čiščenje gp180 iz človeških IEC smo izvedli z afinitetnim stolpcem mAb B9, kot je opisano prej. 9 sekvenciranje beljakovin je izvedlo DNA jedro na Univerzi Rockefeller.

Gradnja vektorjev

Vektor z dvojno ekspresijo CEACAMs in CD1d: cDNA za CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 in CD1d (Genbank št. NM_001024912, NM_004363, NM_002483 in NM_001766) smo dobili z reverzno transkriptazo – PCR iz človeške IEC mRNA. Vsi začetniki so prikazani v dodatni tabeli S1 na spletu. Iz plazmida pIRES-EGFP (Clontech, Mountain View, CA) smo pomnožili notranje ribosomsko mesto vnosa (IRES) s pomočjo naprej (5 '-CCGAATTCATTCCGCCCCTCTCTC-3') in povratnih (5 '-CCGGATCCGGGTTGTGGCAAGC) primerjev. Potem so bili IRES sam (IRES), IRES-CD1d (CD1d), IRES-CEACAM5-GFP, pa tudi IRES-CD1d hkrati s CEACAM1, CEACAM5 ali CEAMCAM6 (CEACAM1.CD1d, CEACAM5.CD1d in CEACAM6.CD1d) subkloniran v pcDNA3.1 (-) vektor (Invitrogen, Life Technology, Grand Island, NY).

Vektorji, ki izražajo mutante CEACAM5: WT CEACAM5 konstrukt je bil uporabljen kot predloga za mutantne konstrukte, ustvarjene s PCR. Za zaporedno C-terminalno oklepanje smo uporabili sprednji temeljni premaz za WT in reverzne prajmere za vse delete mutante, vključno z B3, A3B3, B2A3B3, B3.1, B3.2, B3.3, B3.4 in B3. 5, so prikazani v dodatni tabeli S2. Za pripravo ekspresijskega vektorja za brisanje domene A2 smo izvedli PCR razširitve prekrivanja. Za ustvarjanje fragmenta sta bila uporabljena prednji temeljni premaz za WT CEACAM5 in povratni temeljni premaz (5 '-GACGACCCCACCATTTCCCCCTCA-3'). Predhodni temeljni premaz (5 '-GGTGGGGTCGTCGGGTGGTCTCGCATA-3') in povratni temeljni premaz za WT CEACAM5 sta bila uporabljena za generiranje fragmenta 2 Nato smo ustvarili cDNA z izbrisom A2 domene iz fragmentov 1 in 2 z uporabo prajmov za WT. Fragmente PCR smo subklonirali v CD1d-pcDNA3.1 (-). Generirani so vektorji p91023 (B), ki kodirajo WT in mutirani CEACAM5 z izbrisom ostankov N42 do I46 v N-terminalni domeni (N 42 RQII), točkovne mutacije v domeni N-terminala (K35A in N70, 81A) in CEACAM8 . Zaporedja vseh konstruktov so bila potrjena z sekvenciranjem DNA. CD8α cDNA je zagotovil dr. P. Kavathas (Yale School of Medicine), zunajcelična domena pa je bila klonirana v vektor pcDNA 3.1 / V5-His.

Celična kultura in transfekcija

Za transfekcijo so uporabili človeško embrionalno ledvico (293T), karcinom jajčnikov kitajskega hrčka (CHO) in celične linije melanoma (FO-1). Celice so bile gojene pri 37 ° C v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (GIBCO, Carlsbad, CA) ali v mediju F-12K (ATCC, Manassas, VA), ki je vseboval 10% fetalnega govejega seruma (FBS) v navlaženem 5% CO 2 inkubatorju . Cells were transfected in six-well plates using Lipofectamine-2000 (Invitrogen) with 4 μg of pcDNA3.1 vectors encoding CD1d alone or along with WT or truncated CEACAM5. Untransfected or cells transfected with IRES were used as controls. For the generation of stable cells expressing WT and mutant CEACAM5, cells were transfected in 100 mm culture plates with 12 μg of p91023(B) expression vectors encoding WT or mutant CEACAM5 together with 12 μg of pcDNA3.1. The stable cells were established after selection with 3 mg/ml Geneticin (G418, Sigma, St Louis, MO). Stable cells were treated with 0.1unit ml −1 phospholipase C, phosphatidylinositol-specific enzyme (PIPLC, Sigma) for 1 h at 37 °C. The supernatant was collected and subjected to western blotting using mouse Col-1 and mouse anti-gp180 (B9) monoclonal antibodies. Human IEC cell lines, HT29 and T84, were used as positive controls.

Western blot

The protein samples were subjected to 10% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) gels, transferred to nitrocellulose membranes, and blocked with 5% milk for 1 h at room temperature. Membranes were incubated with primary antibodies overnight at 4 °C, washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween-20 and incubated with HRP (horseradish peroxidase)-conjugated secondary antibody (Cell Signaling, Danvers, MA) for 1 h at room temperature. The proteins were visualized using a chemiluminescent HRP substrate (Millipore, Billerica, MA).

In-cell western blot

A total of 200 × 10 4 CD8 + T cells were seeded in a 96-well flat-bottom plate and starved in RPMI serum-free medium overnight at 37 °C. The next day and before performing the experiments, the plate was placed on ice for 15 min. Cells were stimulated with OKT8 (5 μg ml −1 ) or purified CEACAM5 peptide (10 μg ml −1 ). Unstimulated cells were obtained for each condition. Stimulation was stopped using a 4% formaldehyde buffer for 20 min followed by centrifugation for 10 min at 1, 500 rpm Permeabilization was performed by washing the cells with 1 × PBS containing 0.1% Triton X-100 for 5 min per wash. After permeabilization, cells were incubated for 1 h with the blocking buffer (Odyssey Blocking buffer, LICOR, Lincoln, NE) followed by the primary antibodies goat anti-actin and rabbit anti pLcK or pZap70 overnight at 4 °C. The next day, cells were washed five times with 1 × PBS containing 0.1% Tween 20, incubated for 1 h at room temperature with the secondary antibodies (IRDye 800CW donkey anti goat IgG, IRDye 680 CW donkey anti rabbit IgG), and than washed for five times. Wells were dried, and the plate was scanned using an Odyssey LiCOR system. The software ImageStudio was used for quantification, and each well was corrected taking into consideration the actin expression and the background noise.

Pretočna citometrija

Trypsinized CHO cells (1 × 10 6 ) expressing CEACAM5, 1, 6, and 8 were incubated with the appropriate mAbs B9 and B18 diluted in 100 μl PBS containing 0.2% FBS and followed by a second incubation on ice with FITC (fluorescein isothiocyanate)-labeled F(ab)' 2 fragments of immunosorbent-purified goat anti-mouse IgG.

CEACAM5 mutants transfected CHO cells (1 × 10 6 ) were incubated with the appropriately diluted mAb T84.66 antibody in 100 μl of PBS containing 0.2% FBS followed by phycoerythrin-labeled F(ab)' 2 fragments of immunosorbent-purified goat anti-mouse IgG. Subsequently, cells were washed and co-stained with mAb B9 in 100 μl of PBS containing 0.2% FBS followed by FITC-labeled F(ab)' 2 fragments of immunosorbent-purified goat anti-mouse IgG. Incubations were performed on ice. The cells were then suspended in PBS plus 0.2% FBS and analyzed on a FACScan.

CD8 + T and CD4 + T cells were treated for different time points (2, 8, 10, 15 min) at 37 °C with anti-CD8 mAb (OKT8) at 5 μg l −1, H 2 O 2 at 10 m M, CEACAM5 supernatant (Sup1) from PIPLC-293T cells expressing CECACAM5 and purified CEACAM5 peptide at 20 μg ml −1 . Stimulation was stopped by fixing with 4% formaldehyde for 10 min at room temperature. Subsequently, cells were permeabilized with ice-cold methanol for 20 min, washed with PBS containing 0.2% FBS, and then stained with anti-phospho-Lck Ab (BD Biosciences, San Jose, CA). The cells were then re-suspended in PBS plus 0.2% FBS, data were acquired using the FACScan system (LSRFortessa, BD Biosciences), and analyzed with FlowJo analysis software (Ashland, OR).

So-imunoprecipitacija

293T cells were used for co-immunoprecipitation 48 h after transfection with the corresponding vectors as described above. Cell extracts (150 μg of protein) were incubated with 2 μg of mouse IgG2b anti-CD1d (D5), mouse IgG1 anti-gp180 (B9), isotype control mouse IgG2b, or mouse IgG1 for 4 h at 4 o C, followed by the addition of 10 μl protein G Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) for 12 h. Pellets were washed three times with RIPA buffer (10 m M Tris, pH 8.0, 1.0 m M EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 0.1 M NaCl), boiled in SDS sample buffer, and resolved on SDS-PAGE gels. After transferring to nitrocellulose, an anti-CEA mAb (Col-1) (Dako, Produktionsvej, Glostrup, Denmark) followed by a CD1d mAb D5 western blot was performed.

Absorption assay

In all, 10 μl of PIPLC-treated supernatants from 293T/CEACAM5 cells or from confluent T84 cells were incubated on ice with 14 × 10 6 3G4 (mouse T-cell hybridoma transfected with human CD4 cDNA) or 3G8 (mouse T-cell hybridoma transfected with human CD8 cDNA) cells for 1 h. After incubation, 20 μl of RPMI were added to each tube to facilitate collection of the absorbed supernatants. Supernatants (Sup2) were collected following centrifugation at 13, 000 rpm for 2 min. The entire 30 μl was resolved in 8% SDS-PAGE and subjected to western blotting analysis.

Čiščenje beljakovin

The supernatant obtained from treated PIPLC–transfected CHO cell lines was collected and subjected to mouse anti-CEA (Col-1) mAb Western blotting. Supernatants expressing CEA were subjected to a Col-1 Ab (A/B domain specific) purification column, to dialysis using dialysis membrane tubing with molecular weight cutoff of 12, 000–14, 000, and to concentration using Vivaspin 6 columns. Supernatant obtained from CD8α-transfected 293T cells containing the extracellular domain of CD8α was collected and subjected to a mouse monoclonal anti-CD8α antibody western blotting. Supernatant expressing CD8α was purified using the Probond purification System-Invitrogen specific for polyhistidine-containing recombinant proteins. Eluted protein was then subjected to dialysis and concentration. Eluted proteins were finally subjected to mAb Col-1 (Zymed, Life Technology) and mAb CD8α western blotting (Santa Cruz, Dallas, TX) to confirm the presence of full-length and mutants CEACAM5s and CD8α.

Biacore kinetic analyses

Kot testni pufer smo uporabili 10 m M HEPES pufer (pH 7, 4), 150 m M NaCl, 3 m M EDTA in 0, 005% P20 (polioksietilensorbitan); kot regeneracijski pufer smo uporabili 50 m M Tris, 2 M NaCl in pH 7, 3; kot konjugacijski pufer smo uporabili 10 m M natrijevega acetatnega pufra (pH 5, 0). Prečiščen protein CD8α smo neposredno imobilizirali na karboksimetilirani dekstran z visoko zmogljivostjo in kovalentno pritrdili na zlato površino (čip CM5) s kemijo spajanja amina. Količina ( R L ) beljakovin, ki jih je treba zajeti na čipu, je bila določena z naslednjo formulo: R Max = MW A / MW L • R L, kjer je MW A molekulska masa analita (CEACAM5) (180 KDa) in MW L je molekulska teža liganda (CD8α) (19 KDa). R Max ustreza največji resonančni enoti, ki smo jo dobili med analizami. Nastavili smo R Max <50 za interakcije protitelo / antigen. R L ustreza indeksu refrakcije liganda in je izražen v resonančnih enotah (RU). R MAX 50 je bil R L = 50 × 19/180 = 5, 3. Ligand smo ujeli na čip, dokler ni dosegel 5, 3 RU. RU je resonančna enota, ki nastane s premikom indeksa ognjevzdržnosti zaradi interakcij ligand-analit na senzorskem čipu. K D je opredeljen kot K D = K d / K a.

Biacore meri v realnem času K a (obrestna mera) in K d (off rate) na podlagi svojega programa za prilagajanje krivulj. Hitrost pretoka, ki se uporablja za zajem liganda, je 5 ml min- 1 . Za kinetično analizo se za analit uporablja pretok 30 ml min- 1 . Prva izvedba je skavtska analiza z uporabo visokih koncentracij analita. Za preizkuse smo uporabili 200 n M. Pri tej koncentraciji je treba upoštevati vezavo, tudi če je afiniteta za vezavo ligandov šibka. Skavtska analiza zagotavlja grobo K D. Na podlagi grobe vrednosti K D se izvedejo polne kinetične analize z uporabo petih koncentracij analita, malo nad KD do ničle. Za določitev statistične natančnosti izmerjenega KD smo izvedli Chi kvadrat (χ 2 ) na vrednosti K D, dobljene iz vsake koncentracije analita. χ 2 vrednost ∼ 2 velja za pomembno (natančno) in <1 je zelo pomembno (zelo natančno). Po vsakem preizkusu čip obdelamo s 50 m M Tris, 2 M NaCl in pH 7, 3, da odstranimo ligand in analit za regeneracijo.

Test in vitro supresije

Oceniti učinek CE8AM-aktiviranih CD8 + T celic na periferne celice CD4 + T, ki jih spodbuja protitelesa CD3 / CD28. Celice CD8 + T in CD4 + T so bile pozitivno izbrane z uporabo setov za selekcijo CD8 + in CD4 + T-celic (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Celice CD8 + T smo inkubirali 3 dni v prisotnosti ali odsotnosti očiščenega CEACAM5 ali OKT8 v kombinaciji z IL-15 ali IL-7. Kot pozitivne kontrole smo uporabili kroglice proti CD3 / CD28. Prečiščena CEACAM5 in OKT8 sta bila dodana vsak dan 3 dni. Nato celice speremo, preštejemo in dodamo v razmerju 1: 1 perifernim celicam CD4 + T, ki so označene z karboksifluoresceinskim sukcinimidil esterom (CFSE) (Invitrogen) in bodisi nestimulirane ali stimulirane s kroglicami proti CD3 / CD28. Proliferacijo CD4 + T celic, izmerjeno z redčenjem CFSE, smo analizirali s protočno citometrijo.

Pridružitve

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_001024912
  • NM_001766
  • NM_002483
  • NM_004363

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dopolnilna slika S1

  2. 2

    Dopolnilna slika S2

  3. 3.

    Dopolnilna slika S3

  4. 4.

    Dopolnilna slika S4

  5. 5.

    Dopolnilna slika S5

  6. 6.

    Dopolnilna slika S6

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopolnilne legende figur

  2. 2

    Dopolnilna tabela S1

  3. 3.

    Dopolnilna tabela S2

    DODATNI MATERIAL je povezan s spletno različico prispevka na //www.nature.com/mi