Kopičenje cezija v kvasu in rastlinah selektivno potisne z izgubo polža sec22p / sec22 | narave komunikacije

Kopičenje cezija v kvasu in rastlinah selektivno potisne z izgubo polža sec22p / sec22 | narave komunikacije

Anonim

Predmeti

  • Ekologija rastlin
  • SNARE

Izvleček

Nebistveni kationski cezij (Cs + ) asimilirajo vsi organizmi. Antropogenski sproščeni radiokezij je torej zaskrbljujoč za kmetijstvo. Cs + se kopiči zaradi kemijske podobnosti s kalijevim ionom (K + ). Navidezno pomanjkanje mehanizma privzema Cs + ovira poskuse manipulacije kopičenja Cs +, ne da bi pri tem povzročilo pleiotropne učinke. Tukaj prikazujemo, da protein SNARE Sec22p / SEC22 posebej vpliva na kopičenje Cs + v kvasovkah in rastlinah. Izguba Saccharomyces cerevisiae Sec22p ne vpliva na homeostazo K +, vendar v primerjavi z divjo vrsto prepolovi koncentracijo Cs + . Matematično modeliranje poteka vnosa napoveduje ogroženo vakuolarno odlaganje Cs v sec22Δ . Biokemično frakcioniranje to potrjuje in nakazuje novo značilnost Sec22p pri izboljšanju neselektivnega odlaganja kationov. Razvojno nadzorovan mutant izgube funkcije ortološkega Arabidopsis thaliana SEC22 fenokopira zmanjšan vnos Cs +, ne da bi to vplivalo na rast rastlin. Ta ugotovitev ponuja novo strategijo za zmanjšanje vnosa radiokazija v prehransko verigo.

Uvod

Cs + velja za nebistvenega za organizme. Ker je najredkejši alkalijski kation, ki se ne nabira v tleh, se Cs + v naravnih pogojih ne pripiše škodljivim učinkom. Vendar pa je pridobil ogromen ekološki pomen zaradi antropogenega sproščanja svojega obstojnega radioizotopa 137 Cs ( T ½ = 30, 1 let), zlasti zaradi katastrofalnih dogodkov, kot sta jedrski tlak in eksplozije jedrskih elektrarn v Černobilu ali Fukušimi 1, 2 . Kation, Rb + in Cs + med kationi alkalijskih kovin imajo podobne fizikalno-kemijske lastnosti zaradi podobnih polmerov hidriranih ionov 3 . Zato privzem Cs + in Rb + posreduje transportni sistem kalija, Cs + radioizotopi pa zlahka vstopijo v prehransko verigo prek rastlin 4, 5 . Kmetijstvo na onesnaženih območjih je treba omejiti ali razviti strategije sanacije 6 . Bioremediacija bi lahko temeljila na rastlinah, ki kopičijo večje količine Cs + . Nasprotno je bilo predlagano, da se zmanjša vnos Cs + v prehransko verigo z razvojem „varnejših pridelkov“, ki diskriminirajo Cs + (sklic 7). V ta namen so privzem Cs + intenzivno preučevali. Vnos in transport čez koreninske plazme se štejeta kot ključni vidik in zato obetaven cilj za manipulacijo s Cs + vnosom 5 . Visoka afiniteta vnosa Cs + je bila pripisana prevoznikom tipa H + / KUP tipa K + 5 . Sprejem nizke afinitete, čeprav je manj pomemben za ekološke scenarije, se lahko posreduje prek kanalov tipa CNGC 5 . Medsebojno vmešavanje Cs + z nabiranjem K + ali Rb + ga je nadalje utemeljilo kot substrat za beljakovine, ki jih K + prevzame v rastlinah in drugih organizmih 5, 6, 8, 9 .

Vendar pa Cs + kaže strupenost že v precej nizki koncentraciji glede na visoko znotrajcelično koncentracijo K +, medtem ko Rb + lahko celo nadomesti K + v scenariju, ki je porabljen s kalijem 10 . Prejšnje študije so pokazale, da Cs + lahko zavira ali konkurira procesom, ki so odvisni od K +, in da koncentracije K + in Cs + nista strogo povezana 9, 11, 12 . Zato lahko alternativni transportni procesi omogočijo razlikovanje med temi tesno povezanimi kationi. Kljub temu pa poskusi konkretne manipulacije kopičenja Cs + v rastlinah niso uspeli zaradi posega v K + homeostazo, ki vodi v škodljive, pleiotropne učinke 5 . Diskriminatorni mehanizem vnosa nebistvenega in redkega kationa bi bil presenetljiv tudi z evolucijskega vidika, saj strupene koncentracije v naravi niso dosežene. Zato bi moral biti biotehnološki pristop, ki temelji na mutagenezi, usmerjen k ključnemu vnosu korenin in / ali izvozu beljakovin, da bi dosegli izboljšanje specifičnosti in selektivnosti K + / Cs + 5 . Poleg tega so nedavne analize naravne genske variacije kopičenja Cs + razkrile več kvantitativnih lokusov lastnosti pri pristopih A. thaliana , ki bi lahko bili koristni za določitev dodatnih, morda multigenih dejavnikov v Cs + homeostazi 13, 14 .

Kvas S. cerevisiae ponuja enocelični in preprost preskusni sistem za preučevanje privzema Cs +, saj je bilo dokazano, da uporablja prenašalce kationov in kanale, podobne rastlinskim celicam 8 . Pred kratkim smo uporabili nepristranski pristop za identifikacijo genov kandidatov, ki ogrožajo kopičenje Cs + s presejanjem zbirke kvasovk-izločanja 15 . Vakuolarno vzdrževanje in transport veziklov sta najvišji obogateni kategoriji med identificiranimi geni. Tu podrobneje opisujemo mutantni sec22Δ . Posebej zmanjša kopičenje Cs +, saj homeostaza K + in drugih kationov ne vpliva. Sec22p je dobro opisan nebistveni kvas SNARE, ki je vključen v anterogradno in retrogradno fuzijo membrane veziklov na vmesniku endoplazemski retikulum (ER) –Golgi in v avtofagiji 16, 17 . Modeliranje časov privzema Cs + kaže na vakuolarno sekvestracijo kot ključni dejavnik, ki je ogrožen v mutantu sec22Δ in s tem kaže na novo značilnost funkcije Sec22p v kvasovkah. Čeprav se je ortologu A. thaliana SEC22 izkazalo, da je potreben za razvoj gametofitov 18, smo uspeli prepoznati mutantni alel sec22 , ki je vplival samo na vegetativna tkiva in fenokopiral specifično zatiranje kopičenja Cs + . Rastlinski gen delno dopolnjuje mutant kvas, kar kaže na ohranjen mehanizem. Zato predlagamo, da bo ta nova funkcija, odvisna od Sec22p / SEC22, zagotovila novo pot za ustvarjanje „varnejših pridelkov“.

Rezultati

Kopičenje Cs + se posebej zmanjša v sec22Δ

Prej smo pregledali mutantno zbirko S. cerevisiae z izgubo funkcije za spremenjen vnos Cs + (ref. 15). Med mutanti, ki kažeta zmanjšano koncentracijo Cs +, sta obogateni kategoriji "vakuolarna funkcija" in "prevoz vezikul, posredovani z mehurčki". Trije od teh mutantov, vps35Δ , aps3Δ in apl4Δ , ne vplivajo bistveno na vsebnost K + 15 . Vendar smo ugotovili, da so vsi imeli pleiotropne učinke (dopolnilna slika S1). Zato smo razmislili o nadaljnjih kandidatih z zmanjšanim vnosom Cs +, ki iščejo ne-pleiotropno vedenje in obstoj homolognih genov, kar bi omogočilo potencialno funkcionalno analizo v rastlinah. Seku22Δ med njimi ima divjo vrsto rast in sposobnost preživetja (dodatna slika S1). Poleg tega so proteini, podobni Sec22p, ohranjeni v višjih organizmih, vključno z rastlinami (dopolnilna slika S2a). Študije sledil 134 Cs potrjujejo, da sec22Δ nabira manj kot polovico Cs + v primerjavi s prostoživečim tipom (slika 1a). V nasprotju s tem se kalijev analog Rb + nabira do podobnih koncentracij. Koncentracije esencialnih kationov (K +, Na +, Ca 2+ in Mg 2+ ) ostanejo nespremenjene. Komplementacija z divjim tipom zavira ta Cs + -diskriminacijski fenotip (slika 1a). Tako izguba SEC22p (YLR268Wp) ne moti rasti in sposobnosti preživetja, temveč konkretno zmanjša koncentracijo Cs +, ne da bi to vplivalo na vsebnost K + in drugih bistvenih kationov. V nasprotju s spodnjim nabiranjem Cs +, sec22Δ kaže rahlo povečano občutljivost na Cs + (slika 1d).

Image

( a ) Cs + in Rb + prevzem s mutantom sec22Δ in dopolnjenim sevom ( ScSec22 +). Koncentracije kationov 134 Cs in 86 Rb smo določili iz 10 7 celic po 18 h v YPD, ki vsebuje 50 μM 5-FU in 50 μM CsCl. Referenčni sev BY4741 divjega tipa je vseboval 2, 1 ± 0, 1 mM Cs + ali 2, 3 ± 0, 6 mM Rb + . ( b ) Koncentracije K +, Na +, Ca2 + in Mg2 + so bile v teh pogojih zadržane v mutantu sec22Δ . Koncentracije divjega tipa so bile 164 ± 9, 7 mM K +, 2, 7 ± 0, 1 mM Na +, 31, 4 ± 0, 3 mM Mg 2+ in 1, 2 ± 0, 1 mM Ca 2+ . ( c ) Dopolnitev pomanjkanja C22 +22 pri zaužitju A. thaliana SEC22, izražena pod nadzorom doksiciklin- zaviralnega promotorja. Prisotnost ali odsotnost izražanja S. cerevisiae Sec22 ali A. thaliana SEC22 ter dodatek doksiciklina je označena s +/−. ( a - c ) prikažejo se kvadratne plošče ( n = 10); kvartili določajo meje škatle, antene pa največje in najmanjše vrednosti; zvezdice označujejo pomembne razlike od divjega tipa ( P ≤0, 001, t- test). ( d ) Preskus strupenosti divjega tipa in sec22Δ v seriji redčenja (1/1, 1/5, 1/25, 1/125 in 1/625) pri različnih koncentracijah alkalnih kationov v agarju YPD pH 6. Sivi krogi kažejo na razredčitve pri kateri sec22Δ kaže večjo občutljivost kot divji tip. Velikosti kolonij, 7–8 mm.

Slika v polni velikosti

Zanimivo je, da celice kvasovke divjega tipa kopičijo Cs + po dvofazni kinetiki, ločeni od hiperboličnega vnosa, opisanega za K + / Rb + (ref. 19). Prevzem Cs + vključuje začetni korak, ki doseže približno 0, 35 mM v 2–3 h, in drugi korak, ki doseže planoto pri 2, 2 mM celičnem Cs + po> 16 h (slika 2a). Časovni potek kopičenja sec22Δ Cs + je v začetni fazi približno 2, 5 h zelo podoben kot divji tip (slika 2a-c). Vendar je nadaljnje zaviranje potisnjeno in dosežena je nižja koncentracija v stanju dinamičnega ravnovesja - 1, 1 mM Cs + (slika 2b).

Image

Celocelične koncentracije Cs + so bile zabeležene ob določenih obdobjih po dodatku 50 µM CsCl. ( a ) Časovni tečaj divjega tipa. ( b ) čas 22 sec . Upoštevajte različne lestvice koncentracije v ( a ) in ( b ). Kontinuirane vrstice predstavljajo prilagajanje eksperimentalnih podatkov z matematičnim modeliranjem in napovedmi za razdelitev: prikazane so skupna znotrajcelična (zelena), citoplazmatska (modra) in vakuolarna (rdeča) koncentracija (dopolnilne metode). Koncentracije Cs + v stanju dinamičnega ravnovesja so predvideli pri 2, 1 mM (divji tip) ali 1, 1 mM ( sec22Δ ) v celih celicah, pri 0, 40 mM (divji tip) ali 0, 39 mM ( sec22Δ ) v citoplazmi in pri 7, 1 mM (divji tip) ali 3, 2 mM ( sec22Δ ) v vakuolih . ( c ) Prekrivanje začetnih časovnih tečajev divjega tipa in sec22Δ . ( a - c ) Podatki so predstavljeni kot pomeni ± sd ( n = 10). ( d ) Shema relativne Cs + razdelitve v prostoživečem tipu in sec22Δ . Skupno Cs + kopičenje in vakuolarno Cs + razdelitev smo določili iz celih celic po 18 h inkubaciji v YPD, dopolnjenem s 50 μM radioaktivno označenega Cs + . Ena celovita pita predstavlja 75 amol Cs + na celico (popoln sprejem celic divjega tipa). Izmerjena je bila skupna količina in vakuolarna porazdelitev Cs + in sta bili povezani z enako aktivnostjo vakuolarnega markerja α-mannosidaze, kar je povzročilo vakuolarno odlaganje Cs + ~ 82% (divji tip) in 55% ( sec22Δ ); n = 3 neodvisne izolacije vakuola. ( e ) Shema relativne Rb + delitve, merjena vzporedno s porazdelitvijo Cs + . Celotna pita predstavlja 81 amol na celico (divji tip) in 87 amol na celico ( sec22Δ ). Odlaganje Rb + v vakuolo (70%) je bilo identično za divji tip in sec22Δ ; n = 3.

Slika v polni velikosti

Modeliranje predlaga oslabljeno vakuolarno odlaganje Cs + v sec22Δ

Za nadaljnje razumevanje privzema Cs + in kako sec22Δ vodi do nižjega kopičenja Cs +, smo razvili matematični model, s katerim smo opisali časovni potek divjega tipa in mutantnega privzema Cs + z visoko afiniteto. Pokazalo se je, da se Cs + odlaga v vakuolo celic kvasovk 8 . Zato minimalni model obsega tri oddelke z določenimi volumni, zunajcelični medij ( V 1 ), citoplazmo ( V 2 ) in vakuolo ( V 3 ). Mikroskopsko smo določili celični in vakuolarni volumen približno 35 fl in 9 fl, zato naj bi citoplazemski volumen V 2 znašal 26 fl. Obsežne količine se med divjim tipom in mutantom ne razlikujejo bistveno (slika 3a). Dva toka navznoter in navzven v citoplazmo in iz nje (s konstantama hitrosti k 1 in k 2 ), ter nadaljnja možna sekvestracija v vakuolo in iz nje (s konstantoma hitrosti k 3 in k 4 v tem zaporedju), z linearno predvidevamo odvisnost od koncentracij Cs + (dopolnilna slika S3). Poleg tega model omogoča potencialno zamudo vakuolarnega nalaganja z uvedbo časovno odvisne uregulacije s (t) toka proti notranjemu prostoru. Razvit je bil determiniran model, sestavljen iz navadnih diferencialnih enačb za časovno odvisnost celične Cs + koncentracije tot (t) . Ta model omogoča prilagajanje eksperimentalnih podatkov, pa tudi napovedovanje koncentracij citoplazemskih x (t) in vakuolarnih y (t) Cs +, izraženih z naslednjimi enačbami (slika 2a-c; dopolnilne metode):

Image

Morfologijo vakuolov in pH občutljivost smo analizirali v sec22Δ in divjem tipu. ( a ) Celični (napolnjeni pasovi) in vakuolarni (kvadratki) volumni. V primeru več vakuolarnih mešičkov, obarvanih na celico, smo dodali volumen režnja. Količinski volumen je 35, 2 ± 1, 2 fl (divji tip) in 35, 8 ± 1, 7 fl ( sec22Δ ); in vakuolarne količine so 8, 8 ± 0, 9 fl in 9, 0 ± 1, 2 fl. Barvanje FM4-64 smo uporabili za označevanje vakuolov v živih celicah kvasovk. Ocenjenih je bilo petdeset celic iz treh neodvisnih kultivacij. Podatki so predstavljeni kot srednja vrednost ± sd ( b ) Odstotno razmerje vakuolarnega in celičnega volumna pri različnih zunanjih koncentracijah Cs + ( n = 30 celic). Podatki so predstavljeni kot srednja vrednost ± sd ( c ) Celice z razdrobljenimi vakuoli pri treh različnih koncentracijah zunanjega CsCl kot tudi pri 100 mM zunanjega KCl. Celice z dvema do petimi manjšimi mešički so bile opredeljene kot razdrobljene v nasprotju z običajno anatomijo z eno samo veliko vakuolo. Podatki so predstavljeni v obliki ± sd ( n = 3 s 100 celicami v vsaki neodvisni ponovitvi). Vse analize v ( a, b, c ) so bile izvedene v mediju, bogatem z YPD, po dodatku citostatičnega 5-FU. Tako absolutni in relativni vakuolarni volumen kot tudi vakuolarna morfologija sta bila podobna pri divjem tipu in sec22Δ. Vendar pa ima pri poskusnih pogojih (50 µM Cs + ) sec22Δ bistveno višji odstotek razdrobljenih vakuolov (18, 3 ± 4, 5%) kot divji tip (6, 0 ± 2, 1%) ( P ≤ 0, 01), kar je bilo potrjeno tudi pri 100 µM Cs + . ( d ) Celice divjega tipa in mutirane, gojene v prisotnosti 50 μM CsCl. Normalne in razdrobljene (bele puščice) vakuole so vidne s fluorescenco FM4-64. Lestvica: 10 µm. ( e ) pH občutljivost sevov kvasovk. Divji tip sec22Δ , vma22Δ , vma2Δ in sec22Δ :: Sec22 ( sec22Δ, dopolnjen z divjim tipom Sec22 ) smo testirali na ploščah YPD, puferiranih pri različnem pH (razredčitve serije 1/1, 1/5, 1/25, 1/125 in 1/325). Velikosti kolonij, 7–8 mm.

Slika v polni velikosti

Image
Image

s

Image

τ = k 3 / Γ = 1− k 4 / Γ, Γ = k 3 + k 4,

Image
= 50 μM in funkcija Hill
Image
.

Za divji tip model napoveduje hitro zvišanje koncentracije Cs + v citoplazmi z natančno določenima konstantama hitrosti k 1 in k 2 in zapoznelo sekvestracijo v vakuolo z velikimi, vendar manj ocenljivimi konstantami hitrosti (dodatna tabela S1; dodatna tabela Metode). Pri primerjanju eksperimentalnih podatkov divjega tipa model ocenjuje koncentracije Cs + v citoplazmi 0, 4 mM in 7, 1 mM v vakuoli ob nasičenosti privzema Cs + (slika 2a). Prilagoditev mutantnih podatkov sec22Δ povzroči nepomembno spremenjeno konstanto hitrosti k 1 ( P ≈1), le rahlo spremenjen k 2 ( P = 0, 02) in ponovno zapoznjeno sekvestriranje v vakuolo (dopolnilne tabele S1, S2 in S4). Vendar v nasprotju s prostoživečim tipom napovedujejo znatno ogroženo odlaganje vakuolov Cs + do sec22Δ, ki dosežejo le 3, 2 mM (označeno s P ( τ ) = 1, 15 × 10 −11 ) pri koncentraciji citosolne Cs +, podobne divji vrsti (Slika 2a; dopolnilna tabela S1). Tako model kaže, da opaženi fenotip sec22Δ izhaja iz zmanjšanega vakuolarnega odlaganja Cs + .

Zmanjšano kopičenje Cs + v sec22Δ vakuolih validira model

Za testiranje napovedi matematičnega modela na vakuolarnem odlaganja Cs + smo izolirali vakuole Cs + -laden iz celic divjega tipa in mutiranih, izmerili pa so zasedene dele Cs + glede na celične lizate. Celice divjega tipa in mutirane snovi vsebujejo podobne količine sekretornega sistema, neodvisnega vakuolarnega markerja α-mannosidaze v kvasu 20, ki se uporablja za normalizacijo analiz Cs + (dopolnilna slika S4). Skupni Cs +, prevzeti v celice divjega tipa (75 amol na celico s koncentracijo 2, 1 mM), razdelimo na citoplazmo v koncentraciji 0, 78 mM in na vakuolo pri 6, 9 mM. V tem primeru se v vakuolo odloži ~ 82% celotnega Cs + (slika 2d). Tako visoka izterjava Cs + kaže tudi na to, da smo se potencialnim izgubam med postopkom izolacije uspešno izognili. Število se tudi ujema s predhodnimi analizami Cs + predelka 21, vendar lahko kljub temu predstavlja spodnjo mejo vakuolarne vsebnosti. Nasprotno, sec22Δ (39 amol na celico; 1, 1 mM) kaže celični delček 0, 66 mM Cs + v citoplazmi in 2, 4 mM v vakuoli. Kalijev analog Rb + je podobno razdeljen na citoplazmo in vakuolo divjega tipa in mutantnih celic (slika 2e). Tako je splošno znižanje kopičenja Cs + s sec22Δ posledica posebno kompromitirane razdelitve na vakuolo, ki vsebuje le približno tretjino količine divjega tipa (22 amol na celico v primerjavi z 62 amol v divji vrsti). Ta rezultat se dobro ujema z napovedmi matematičnega modela (slika 2a). Zmanjšanje vnosa Cs + ni posledica zmanjšanja volumenskega volumna ali velikosti celic, saj oboje na divji tip in mutantne celice po inkubaciji v mediju YPD, ki vsebuje Cs +, ne vplivajo različno (slika 3a). Nasprotno pa Jorgensen in sod. 22 poročalo o celo nekoliko povečani srednji velikosti celic sec22Δ . Vendar pa smo opazili večjo frekvenco celic, ki vsebujejo več manjših vakuolov v mutantu, kar ni očitno pri celicah, ki rastejo brez Cs + (slika 3c). Tako obstaja Cs + -odvisen morfološki vpliv na sec22Δ vakuole.

Model tudi predlaga, da zmanjšani vnos Cs + sec22Δ ni odvisen od razlik v plazemski membrani (dodatna tabela S1). To vprašanje smo rešili tako, da smo 2 uri po zamenjavi zunanjega sledilca z neoznačenim Cs + zabeležili izgubo sledilca Cs + iz celic Cs + -laden pri ravnotežnih pogojih 2 uri. Začetna hitrost iztoka iz divjega tipa in mutantnih celic pri t = 0 h je bila 0, 62 ± 0, 11 mM h –1 in 0, 52 ± 0, 09 mM h –1 . Tako izpust ni bistveno spremenjen v sec22Δ ( P = 0, 34; dodatna slika S5). Zmogljivosti modelirane stopnje iztoka (divji tip: 1, 2 h −1 × 0, 40 mM = 0, 48 mM h −1 ; sec22Δ : 1, 9 h −1 × 0, 39 mM = 0, 74 mM h −1 ) (slika 2a; dodatna tabela S1) se strinjajo s temi eksperimentalno določenimi vrednostmi. Če povzamemo, so ti rezultati v skladu s napovedjo podobnih Cs + tokov na plazemski membrani v divjem tipu in sec22Δ .

Cs + prevzemanje mutantov kationskih transportov se razlikuje od sec22Δ

Za nadaljnje raziskovanje in potrditev rezultatov za potisnjeno kopičenje Cs + in vakuolarno sekvestracijo v sec22Δ so bili uporabljeni dodatni mutanti z znanimi napakami pri uvozu in izvozu kationov, da analizirajo njihov vpliv na vnos Cs + . Zapisan je bil časovni potek vnosa Cs + za trk1Δ , trk2Δ in trk1Δ trk2Δ , kot tudi za ena1-4Δ . Visoko afinitetni transporter Trk1p in njegov homolog Trk2p sodelujeta pri zaužitju kalija v plazemski membrani; grozdna skupina Ena1-4 kodira ATPaze, povezane s kationovim izlivom 23, 24 . V vseh primerih, razen trk2Δ , se čas vnosa teh mutantov, ki vplivajo predvsem na kationski transport v plazemski membrani, bistveno razlikuje od posameznih divjih vrst in, kar je še pomembneje, od sec22Δ (sliki 2 in 4). Tako te analize podpirajo različno vlogo Sec22p pri kopičenju Cs + .

Image

Časovni potek celoceličnih koncentracij Cs + je bil zabeležen ob določenih obdobjih po dodatku 50 µM CsCl mutantom, ki vplivajo na transport kationov v plazemski membrani in ustreznih divjih tipih. ( a, b ) Podatki so predstavljeni kot pomeni ± sd ( n = 10). Neprekinjene vrstice predstavljajo prilagajanje koncentracij celic Cs + po matematičnem modelu (dopolnilne metode). ( a ) Časovni potek trk1Δ , trk2Δ in trk1Δtrk2Δ in ustrezen divji tip. ( b ) Časovni potek ena1-4Δ in ustrezen divji tip.

Slika v polni velikosti

Mutirani trk1Δ vodi do oslabljenega povečanja Cs + in do daljše začetne faze, dokler nadaljnja akumulacija po 18 h ne doseže skoraj divjega tipa, medtem ko je sprejemna pot trk2Δ skoraj neločljiva od divjega tipa (slika 4a). Tako ti podatki jasno kažejo, da (i) Trk1p sodeluje pri prevzemu Cs + in (ii) Trk2p očitno ne prispeva, dokler so Trk1p ali drugi mehanizmi učinkoviti. Vendar pa je za učinkovito privzem Cs + potrebna kombinirana prisotnost Trk1p in Trk2p, saj se v analiziranem časovnem poteku kopičenje Cs + drastično zatira v trk1Δ trk2Δ (slika 4a). Te podatke smo sprejeli tudi po zgoraj opisanem matematičnem modelu, vendar smo uporabili znanje o specifičnih pomanjkljivostih trk1Δ in trk2Δ pri kationskem toku pri predpostavki nespremenjenega divjega tipa, ki je podoben divjemu toku pri plazemski membrani. V vseh primerih je predvidena sekvestracija Cs + na vakuolo podobna. Modelirane konstante hitrosti priliva k 1 so za trk2Δ nespremenjene, vendar za trk1Δ nekoliko zmanjšane in za trk1Δ trk2Δ (dodatna tabela S3).

Vmešavanje v kation plazme iz membran skozi mutant ena1-4Δ povzroči močno pospešen vnos Cs + in navidezno izgubo začetne faze divjega časovnega poteka. Vendar je dosežena enakomerna koncentracija Cs + v naravi, čeprav v zgodnejši časovni točki (slika 4b). Ta poskus jasno podpira fiziološko vlogo Ena1-4p v Cs + izlivu na plazemski membrani; njegova izguba omogoča hitrejše kopičenje Cs + . Prilagoditev teh podatkov matematičnemu modelu, v tem primeru ob predpostavki, da je nedotaknjena konstantna hitrost dotoka k 1 , podobna divjemu tipu, napoveduje znižano stopnjo k 2 v skladu s predlagano biološko funkcijo Ena1-4p (dodatna tabela S4). Poleg tega omejitev koncentracije Cs + v stanju dinamičnega tipa kaže, da bi morale biti mutacije ena1-4Δ poleg učinka na izliv plazemske membrane tudi druge neznane posledice.

SEC22 v A. thaliana vpliva na kopičenje Cs +

Uporabili smo modelno rastlino A. thaliana, da smo raziskovali, ali bi bila zavzetost C22 +, odvisna od C22 +, v enoceličnem evkariotu opažena tudi v višji rastlini. SEC22 ( At1g11890 ) kodira protein s 36% identiteto na ravni aminokislin v primerjavi s kvasom Sec22p, ki deli vse funkcionalne domene (dopolnilna slika S2b). Označen je bil kot SNARE, ki je vključen v promet anterogradnih veziklov na vmesniku ER do Golgija 25 . Za razliko od ortologa S. cerevisiae S. A. thaliana SEC22 je bistvenega pomena, saj je potreben za razvoj gametofita 18 . Vendar pa smo uspeli obnoviti popolnoma održiv in rodoviten, razvojno nadzorovan mutantni alel izgube funkcije sec22-3, ki vsebuje vstavitev T-DNA v 5 ' -UTR At1g11890 (SALK_042819; Sliki 5a in Slika 6) . Analize PCR s povratno transkripcijo (RT – PCR) razkrivajo, da temu alelu selektivno primanjkuje funkcionalnih prepisov v vegetativnem tkivu (korenina, steblo in listi), vendar ohrani izražanje v reproduktivnih organih in mladem tkivu, verjetno zaradi kriptične promocijske aktivnosti vstavka T-DNA. (Slika 5b). Mutant sec22-3 je bil pregledan glede na spremenjeno kopičenje Cs + . Zniža se na približno polovico koncentracije divjega tipa v listih rozete in za približno tretjino v koreninah, medtem ko vsebnost Rb +, K +, Na +, Mg 2+ in Ca 2+ ostane nespremenjena (slika 7) . Dopolnjevanje z divjim tipom Arabidopsis SEC22 zavira fenotip. To kaže, da rezultate, dobljene s kvasom sec22Δ, fenokopira rastlinski mutant, kar kaže na podobno funkcionalno vključenost v obogatitev s Cs + . Za reševanje te enakovrednosti je bil Arabidopsis SEC22 kloniran v doksiciklinski represivnem vektorju (dopolnilne metode) in je hitro izražen v mutantnem kvasovcu sec22Δ . Arabidopsis SEC22 lahko povrne nizko Cs + kopičenje sec22Δ in doseže ~ 85% divjega tipa. To reverzijo odpravimo z zatiranjem ekspresije transgena z doksiciklinom (slika 1c). Tako lahko rastlinski gen SEC22 funkcionalno dopolnjuje mutant mutacije kvasovke sec22Δ .

Image

( a ) Genska struktura At1g11890 je shematično prikazana, vključno s položajem vstavitve T-DNA v alel sec22-3 (SALK_042619). Barvne puščice kažejo naprej in nazaj temeljne premaze, ki se uporabljajo za povečanje označenih kombinacij eksona z RT-PCR. ( b ) RT-PCR analiza transkripcije SEC22 v divji tip in sec22-3 listov (L), korenine (R), stebla (S), enotedenske sadike (SE), listje kave (CL), cvetovi na stopnji 7–9 (F) in odprti cvetovi (OF, stopnja 14, s silikatom v zgodnji fazi) 60 . Sondirali so štiri različne kombinacije eksona SEC22, kot so opredeljene v ( a ). Za pozitivno kontrolo smo uporabili transkripcijo A. thaliana TUB9 ; vse kombinacije so bile testirane +/– povratna transkriptaza. kot označevalce velikosti (na levi strani) smo uporabili pUC19, ki ga je razrezal Msp I (za TUB9 in ekson 1-3 ) ali λ DNA, ki ga je razrezal Hin dIII; velikosti amplikona: TUB9 , 184 bp; ekson 1–3, 350 bp; ekson 2–4, 410 bp; ekson 3–5, 318 bp; in ekson 4–6, 256 bp.

Slika v polni velikosti

Image

( a ) Razvoj rastlin je bil količinsko določen z merjenjem biomase (sveža teža) zračnih delov v navedenih časovnih točkah ( n ≥15). Razmerje med svežo in suho maso je bilo 12, 1 ± 1, 8 za divji tip in 11, 6 ± 2, 2 za sec22-3 ( n = 6). Stopnje kalitve so bile enake tako na tleh (86% ± 2% v divjem tipu in 88% ± 2% v sec22–3 ) kot tudi v hidroponski kulturi (100% v divjem tipu in 95% ± 2% v sec22–3 ). Podatki so predstavljeni kot sredstva ± sd; n ≥20. ( b ) mutant ni odkril očitnih razvojnih napak v primerjavi z divjim tipom; zlasti razvoj cvetov ni bil spremenjen. Velikostne palice: zgornja plošča 0, 5 cm; spodnja plošča 2 cm.

Slika v polni velikosti

Image

Kopiranje Cs + in Rb + v listih in koreninah 20-dnevnih rastlin divjega tipa in sec22-3 so analizirali v poskusih zajemanja sledilcev; količine so povezane s svežo težo. Vsebnosti K +, Na +, Ca2 + in Mg2 + so bile izmerjene z atomsko emisijsko spektroskopijo in se nanašale na suho maso. Razmerje med svežo in svežo maso se ni razlikovalo med divjim tipom in sec22-3 (slika 6). Sto odstotkov ustreza 107 ± 8, 2 nmol Cs + g −1 ustrelil (rozeta); 43 ± 6, 6 nmol Cs + g -1 koren; 158 ± 7, 7 nmol Rb + g −1 poganjkov; 53 ± 7, 4 nmol Rb + g -1 koren; 1, 3 ± 0, 4 mmol K + g -1 posnetek; 0, 62 ± 0, 08 mmol K + g -1 koren; 0, 2 ± 0, 003 mmol Na + g -1 posnetek; 0, 15 ± 0, 01 mmol Ca 2+ g -1 odstrela; in 0, 3 ± 0, 01 mmol Mg 2+ g -1 posnetka ( n ≥ 5, vsaka ponovitev, sestavljena iz najmanj šestih rastlin). Prikazane so kvadratne plošče z zgornjim / spodnjim kvartilom, minimalnimi in maksimalnimi vrednostmi (antene) in eno zunanjo (črna pika); zvezdice označujejo pomembne razlike od divjega tipa ( P ≤0, 001, t- test). Izraz AtSEC22 je naveden kot + (dopolnjena vrstica) ali - (mutant).

Slika v polni velikosti

Diskusija

Kemična podobnost nebistvenega alkalijskega kationa Cs + z esencialnim K + je glavna ovira za genetske poskuse manipulacije kopičenja radiokazija in preprečevanja njegovega vstopa v prehransko verigo 5, 6, 9 . V tej študiji pa dokazujemo, da je specifična diskriminacija Cs + možna pri mutantu kvasa s ec22Δ , medtem ko se drugi kationi, vključno s K +, zadržijo na divji ravni. Presenetljivo je tudi, da je izguba ortološkega izražanja A. thaliana SEC22 v vegetativnih tkivih posebej znižala koncentracije Cs + v rastlinah (sliki 1 in 7). Matematično modeliranje in biokemijska karakterizacija mutantnega kvasa kaže, da je sekvestracija Cs + do vakuole močno ogrožena.

Specifični učinek izgube Sec22p na vnos Cs + je podprt tudi z različnimi poteki privzema mutantov, ki omejujejo priliv ali iztok plazemskih membran. Poleg tega ti poskusi v pogojih z visoko afiniteto jasno potrjujejo sum na vlogo Trk1p in Trk2p v Cs + prilivu čez plazemsko membrano 8, 24 in, nasprotno, vpliv kationskih transportov, ki jih poganja Ena1-4p, v Cs + iztisnitev celice. Tečaji privzema Cs + kažejo zanimivo dvofazno vedenje z začetnim platojem tako mutantnih celic divjega tipa kot sec22Δ, preden se nadaljuje nadaljnja akumulacija. To opazovanje kaže na prag, ki vodi do pojava nadaljnje sekvestracije Cs + do vakuole. Podobno vedenje je bilo opaziti pri trk1Δ , čeprav je druga faza zamujala, medtem ko pri ena1-4Δ začetni fazi očitno primanjkuje. Obe ugotovitvi sta lahko v sorazmerju z zaostajajočim prilivom Cs + v trk1Δ ali hitrejšim kopičenjem Cs + v ena1-4Δ .

Diskriminacija Cs + pri vakuoli pri sec22Δ mutatih je specifična glede na bistveni kation K + . Skupna koncentracija K + in razdelitev Rb + se ne razlikujeta od divjega tipa, kar kaže na nespremenjene vakuolarne ravni K + . Vakuolarna koncentracija K + je bila ocenjena na približno 440 mM za celice divjega tipa in sec22Δ na podlagi (i) relativnih količin prekazov , (ii) izmerjene skupne koncentracije K + v celih celicah (slika 1) in (iii) predpostavka vakuolarne porazdelitve K +, analogne Rb + (slika 2e). Ustrezna koncentracija citosolne K + je ~ 63 mM. Poleg tega je specifičnost sekvestracije Cs + na vakuolo podkrepljena z dejstvom, da bi že manjše spremembe vakuolarne koncentracije K + sec22Δ znatno zmanjšale celotno raven K + (česar ni bilo opaziti), pod pogojem, da citosolna K + homeostaza ga je treba ohraniti, da ohrani divjo vrsto rast in sposobnost preživetja v mutantu sec22Δ 26 .

V nasprotju z našimi ugotovitvami Fell in sod. 27 je tudi predlagalo učinek na homeostazo K + v sec22Δ, ki temelji na oslabljenem kopičenju Rb + v zgodnji fazi preizkusa vnosa v gojišču s pomanjkanjem hranil. Pokazalo se je, da spremenjena homeostaza K + vpliva na občutljivost za kationska zdravila 28, zato je lahko povezana tudi s Cs + fenotipom sec22Δ . Vendar je v nasprotju s sredstvom, ki ne vsebuje hranil, zgodnji čas vnosa Rb + enak za divji tip in sec22Δ v mediju, ki je bogat z YPD (dopolnilna slika S6), koncentracije Rb + in K + v stanju dinamičnega ravnovesja pa ne vplivajo. bodisi (glej zgoraj).

Zdi se, da je Sec22p / SEC22 bistvenega pomena za vnos in sekvestracijo Cs + v naravi, saj njegova izguba funkcije vodi do posebej zmanjšanega vnosa Cs v kvasovke in Arabidopsis . SNARE Sec22p je vključen v različne vidike ciljanja na beljakovine in avtofagije (glej prvi del besedila). Klasična vloga Sec22p kot v-SNARE je v zgodnjem anterogradnem transportu vezikulov 29 . Rezultati tega dela kažejo na nadaljnjo povezavo z vakuoli. Z združitvijo proteoliposomov, ki nosijo R-SNARE Sec22p in vakuolarne Qabc-SNARE, se je pokazala neposredna udeležba ER-/ Golgi-rezidenta Sec22p na vakuolarnih membranah. Čeprav R-SNARE malo prispeva k specifičnosti fuzije in relevantnost in vivo še ni bila raziskana, to delo dokazuje biofizično sposobnost Sec22p za interakcijo z vakuolarnimi membranami 30 . Druga povezava z vakuolarnimi funkcijami zagotavlja soodgovornost Sec22 in Vma22 v transkriptu 31 kvasovk. ER-rezident Vma22p je potreben za sestavljanje V-ATPaze, ki zakisa vakuolarni lumen 32 . Zmanjšana aktivnost V-ATPaze povzroči povečano občutljivost za pH in zaviranje kationov v vakuolo 33 . Vendar ima sec22Δ le šibko občutljivost za pH v primerjavi z vma22Δ in mutantom V-ATPase mutant vma2Δ (slika 3e) 32, 34 . To opazovanje kaže, da fenotip sec22Δ Cs + ni posledica motenja vakuolarnega pH, kar je tudi v soglasju z nespremenjenimi K + in Rb + homeostazo v mutantu SNARE (slika 1).

Zato ima Sec22p očitno bolj specializirano, odvečno vlogo, ki vpliva na specifičnost odlaganja Cs + v vakuolo. Čeprav je podroben molekularni mehanizem še vedno prikrit, glede na znane funkcije Sec22p in njegovo morebitno dodatno povezavo z vakuolo, lahko sodeluje pri ciljanju prevoznikov ali beljakovin, ki modulirajo specifičnost, da bi spremenili učinkovitost zaseganja kationov v vakuolo. Potencialne tarče, ki jih je treba spremeniti na tonoplastu, sta H + / kation izmenjalni proteini Vnx1p in Nhx1p 35, 36, 37. Poleg tega bi lahko izguba sec22Δ privedla do izločanja takšnih beljakovin. Nedavno so poročali o delnem uvajanju plazemske membrane Trk1p v še nedoločen znotrajcelični oddelek v mutacijskem ozadju sec22Δ 27 .

Uspešen prenos Cs + -diskriminacijskega fenotipa z enoceličnega modela kvasa na višjo rastlino vpliva na možne strategije za vzrejo „varnejših pridelkov“. Čeprav je Arabidopsis SEC22 bistvenega pomena za širjenje 18, to delo kaže, da njegova specifična izguba funkcije v vegetativnem tkivu omogoča divjo vrsto rast in razvoj, hkrati pa zmanjšuje kopičenje Cs + (sliki 6 in 7). Torej bi lahko za organ zaviranje SEC22 zmanjšalo vstop radiokazija v prehransko verigo, ki bi ga bilo mogoče uporabiti tudi v povezavi z drugimi pristopi, kot je manipulacija specifičnosti K + -prevoznika ali kmetijski ukrepi, kot je K + obogateno gnojenje 5 . Ohranjanje homologov SEC22 pri rastlinskih vrstah podpira takšno strategijo.

Metode

Kemikalije

Vse kemikalije so bile kupljene v najvišji razpoložljivi kakovosti pri Sigmi (Nemčija), Merck (Nemčija), VWR (Nemčija) ali Serva (Nemčija). Radiokemična sredstva so bila pridobljena pri AEA Technology (Nemčija), GE Healthcare (Nemčija) ali Hartmann Analytics (Nemčija).

Sevi kvasovk in pogoji rasti

Mutantni sevi sec22Δ, vps35Δ, apl4Δ in aps3Δ so izogeni glede na BY4741 (MATa; his2Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0 ) in so bili pridobljeni iz EUROSCARF (Inštitut za molekularne bioznanosti, Univerza v Frankfurtu). trk1Δ (PLY234) , trk2Δ (PLY236) in trk1Δtrk2Δ (PLY240) so izogeni do PLY232 (MATa; his3Δ200 leu2-3, 112 trp1Δ901 ura3-52 suc2Δ9 ) (ref. 24). ena1-4Δ (G-19) je izogenski za W303.1 (ref. 23). Preoblikovanje kvasovk smo izvedli z dodatkom 500 ng plazmidne DNK v 75 μl eksponentno gojenih kvasnih celic, ki so permealizirane z litijevim acetatom 38 . Genomski fragment 3 kb, ki obsega gen kvasa Sec22, smo amplificirali s primerjema SEC22coXmaIfw in SEC22coHindIIIrv (dopolnilna tabela S5) in ga po omejitvi z Xma I in Hin dIII vstavili v plazmid Yep352 za ​​dopolnitev sec22Δ (ref. 39). Za dopolnjevanje kvasovk sec22Δ z Arabidopsis SEC22 ( At1g11890 ) smo odprti bralni okvir amplificirali z uporabo oligonukleotidov SEC22fwClaI in SEC22revNotI (dopolnilna tabela S5) in klonirali v vektor pCM189 40 po omejitvi s Cla I in Not I, kar je omogočilo doksiciklin- izraz. Celice kvasovk so gojile na mediju YPD, pH 6, 0 pri 30 ° C, če ni drugače navedeno 41 . Mutanti trk1Δ , trk2Δ in trk1Δ trk2Δ ter njihovi ustrezni sevi divjega tipa so bili gojeni v YPD, dopolnjeni z dodatnimi 100 mM KCl.

Analize zavzema kvazija in rubidija

Cs + testi akumulacije na 96-jamskih ploščicah MultiScreen HTS (Millipore, Nemčija) smo izvedli z uporabo 1 × 10 7 celic na vdolbinico v 200 μl. Celice smo inkubirali v mediju, bogatem z YPD, ki je bil 4 ure pred začetkom inkubacije sledilcev preskrbljen s 50 µM 5-fluorouracilom (5-FU). To je povzročilo rast in zaustavitev delitve celic, ne da bi vplivalo na sposobnost preživetja kvasovk, v skladu z literaturo 42 . Po spiranju s H20 smo celice resuspendirali v 100 μl YPD plus 50 μM 5-FU. Po 1 uri regeneracije smo dodali enako količino YPD, dopolnjeno s 50 µM 5-FU in 100 µM CsCl, ki vsebuje 4 kBq ml -1 134 Cs. Plošče inkubiramo pri 30 ° C na stresalniku pri 100 vrt./min. Preizkuse zaustavimo tako, da dvakrat speremo celice pred γ-spektrometrično analizo. Ta eksperimentalna nastavitev je omogočala navidezno konstantne pogoje vnosa, saj je bilo 50 μM zunanjih Cs + kvečjemu izčrpano na 44 μM. Podoben pristop je bil uporabljen za določanje vsebnosti Rb + po 18 h z uporabo 50 µM RbCl, ki vsebuje 10 kBq ml −1 86 Rb kot radioaktivni sledilnik. Poleg tega smo izvedli začetno fazo kopičenja Rb + v divjem tipu BY4741 in sec22Δ v pogojih, omejenih s hranili (50 mM HEPES Tris, pH 7, 0, dobavljen z 2% glukoze) brez dodajanja 5-FU v primerjavi z bogatim medijem .

Za eksperiment z odtokom so bile celice kvasovk, inkubirane v 50 μM 134 Cs sledljivem YPD, ki vsebuje 50 μM 5-FU, pobrane po 18 urah in dvakrat izperene z gojiščem, ki ni sledi. Celice smo inkubirali v mediju brez sledov, ki vsebuje 50 μM CsCl pri 30 ° C, in analizirali v določenih časovnih točkah kot zgornje celice.

Analiza občutljivosti sevov kvasovk

Za preskuse strupenosti kationov smo celice kvasovk replicirali na plošče YPD, dopolnjene z različnimi koncentracijami NaCl, KCl in CsCl. Za testiranje občutljivosti na pH smo na selektivnih YPD ploščah z različnim pH gojili vrsto redčenja preko nočnih kultur (OD 600 = 0, 8-1, 0), prilagojeno z 20 mM MES-NaOH (pH 5, 5 in 6, 5) ali 20 mM HEPES-NaOH (pH 7, 5 in 8, 0).

Izolacija nepoškodovanih vakuolov za analizo razdelitve Cs +

Vakuole smo izolirali s stopenjskim gradientom gostote Ficoll iz sferoplastov, pridobljenih iz 1 l celic s sledilnimi kolesi (OD 600 = 0, 8) (ref. 41, 43, 44). Celice kvasovk so 18 ur inkubirali pri 30 ° C v YPD, ki je vseboval 50 µM 5-FU z 50 µM CsCl ali RbCl, označen s 50 kBq l −1 134 Cs oziroma 500 kBq l −1 86 Rb. Po encimski prebavi celične stene smo izvedli vse korake pri 0 ° C, da smo zmanjšali potencialno izgubo Cs + . Celice smo osmotsko lizirali z Douncesovo homogenizacijo v 10 mM Tris-MES, pH 6, 9, 12% Ficoll, 0, 1 mM MgCl 2 in 500 U ml -1 koktajlu zaviralca proteaze (Sigma, Nemčija). Po ultracentrifugiranju (30 min, 50.000 g ) se peleta zadrži kot frakcija 1. Plavajoči material je bil izoliran in prekrit z 8 in 4% Ficollom za nadaljnje centrifugiranje (45 min, 50.000 g ). Zbrali smo pelete (frakcija 2) in plavajočo vakuolarno frakcijo (frakcija 3). Aktivnost α-mannosidaze v 134 Cs sledilnih celičnih lizatih smo določili v 2 ml alikvotih in lizate razredčili tako, da ustrezajo encimski aktivnosti izoliranih vakuolov v 6 ml volumnu.

Encimatski testi za frakcijo celic kvasovk

Za določitev frakcij, dobljenih z frakcioniranjem gradientov gostote (Dopolnilna slika S4), smo uporabili markerski encimski test. Vse frakcije so bile pred analizo alikvotov prilagojene na enak volumen (500 μl). Sferoplasti so bili uporabljeni kot referenca za celice. Vse dejavnosti se nanašajo na enakovredne dele posameznih frakcij. Aktivnost ATPaze v plazmatski membrani, občutljivi na vanadate, smo količinsko določili z vanadata občutljivim sproščanjem fosfata iz ATP v prisotnosti 5 mM natrijevega azida 45, 46 . Peroksisomalno marker katazozo A smo preizkusili po metodi titanovega oksi-sulfata 47, 48. NADPH citokrom c reduktaza je bila uporabljena kot ER marker, ki temelji na zmanjšanju citokroma c v prisotnosti NADPH in rotenona 48 . Aktivnost α-1, 6-mannosiltransferaze je bila preizkušena kot Golgijev marker z uporabo GDP- [14C] -mannoze in α-1, 6-mannobioze kot substrata 49, 50 . Mitohondrijska marker sukcinata dehidrogenaza je bila preizkušena s količinsko določitvijo reducirane p -iodonitrotetrazolijeve vijolične 48, 51 . Končno sta bili kot markerja za vakuolarni lumen in membrano uporabljeni karboksipeptidaza Y in a-D -mannozidaza 28, 52, 53 . Aktivnost karboksipeptidaze Y je temeljila na sproščanju levcina iz N-CBZ-L -Phe-L-Leu. Aktivnost α-D -mannozidaze smo izmerili z uporabo p -nitrofenil-a-D -mannopiranozida kot substrata.

Rastlinske linije in pogoji rasti

Rastline za nadzor nad divjim tipom so bile A. thaliana Pridružitev Col-0. Linija za vstavitev T-DNA SALK_042619 ( sec22-3 ) je bila pridobljena iz Stockting Centra 54, 55 Nottingham Arabidopsis in preverjena z zaporedjem DNK. Homozigotne vstavne črte so bile izbrane s PCR (dodatna tabela S5) in značilne z RT-PCR (slika 4b in dodatna tabela S4). Rastline so bile gojene bodisi v hidroponiki po sterilizaciji semenskih površin 14 bodisi na negnojeni, namakani talno-peščeni substrat po stratifikaciji 2 dni s 16 h svetlobe (75 µmol m −2 s −1 ) pri 21 do 23 ° C.

Komplementacija A. thaliana sec22-3

Gen Arabidopsis SEC22 ( At1g11890 ) je bil ponovno sestavljen iz fragmentov, dobljenih s PCR, s kombinacijami prajmov (I) PromSecfwXmaI , + PromSecrevClaI , (II) SEC22fwClaI + SEC22revXhoI in (III) TermSecfwXhoI + TermSecrevPstI (nadaljnja omejitev), Cla I, Xho I ali Pst I). Te fragmente smo vezali v vektor pBGW 55, 56, ki sta ga razrezala Xma I in Pst I. Pravilno zaporedje smo preverili z zaporedjem DNK. sec22-3 rastline smo transformirali po cvetni metodi z Agrobacterium tumefaciens pGV301 / pMP90, ki vsebuje pBGW derivat 57 . Za nadaljnjo analizo je bila uporabljena homozigotna linija z enim vstavkom.

γ-Spektrometrična analiza 134 Cs in 86 Rb

Celice kvasovk smo pred γ-spektrometrično analizo raztopili v 3 ml 3 M HNO 3 s štetjem 60 minut v Wallac WIZARD 1480 (Perkin Elmer, Nemčija) na podlagi spektralnih vrhov za 134 Cs (605 in 796 keV) in 86 Rb (1077, keV). Vakuolarne frakcije kvasovk smo analizirali v 6 ml izolirane frakcije. Za vzorce Arabidopsis je bilo vsaj sedem 20-dnevnih rastlin iz hidroponskih kultur, dopolnjenih s 5 µM CsCl, ki vsebujejo 12 kBq l −1 134 Cs ali 5 µM RbCl z 24 kBq l −1 86 Rb, združenih na ponovitev 14 . Zračni del (rozeta, vključno s steblom) je bil ločen od korena pod hipokotilom. Material enkrat izperemo z vodo, na kratko posušimo na papirju za tkivo, resuspendiramo v 3 ml vode in analiziramo.

Določitev neoznačenih koncentracij kationov

Kulture kvasovk smo 18 ur pretresli (30 ° C; 100 vrt./min.) V 50 ml YPD, ki vsebuje 50 μM 5-FU. Celice (OD 600 ≈0, 8) smo zbrali na 45 μm filtrih in jih čez noč raztopili v 3 ml 30% HNO3 pri 60 ° C. Po trikratnem redčenju s H20 smo analizirali 5 ml z induktivno sklopljeno plazemsko atomsko emisijsko spektrometrijo (Optima 7300, Perkin Elmer, Nemčija), opremljeno z morskim nebulizatorjem, ki je pritrjena na ciklon škropilno komoro (AHF Analysentechnik, Nemčija). Izmerili smo naslednje elementarne emisijske črte: Ca 2+ : 317.933 nm; K + : 766.490 nm; Mg 2+ : 279.077 nm; in Na + : 589.592 nm. Koncentracije so bile določene z zunanjo kalibracijo. Korenine in listi Arabidopsis iz najmanj osmih rozetah ali koreninskih sistemih so združeni na vzorec. Katione smo določili z atomsko emisijsko spektrometrijo iz 2 mg liofiliziranih korenin ali listov rozete.

Mikroskopija

Mikroskopske analize so bile izvedene z Olympusom BX61, opremljenim s programsko opremo Cell * P (Olympus, Evropa). Celice kvasa in vakuole so bile preštete na hemocitometru tipa Neubauer. Celične in vakuolarne količine smo določili po obarvanju celic (OD 600 <1.0) s 15 μM SynaptoRed C2 (= FM4-64) (Biotium, Kalifornija, ZDA; vzbujanje 525 nm, emisija 647 nm), kar smo uporabili tudi kot kazalnik preživetja 58 . Celični (35 fl) in vakuolarni (9 fl) volumni za divji tip v naših poskusnih pogojih so v skladu z literaturo 59 .

Dodatne informacije

Kako citirati ta članek: Dräxl, S. et al. Akumulacija cezija v kvasu in rastlinah se selektivno potisne z izgubo SNARE Sec22p / SEC22. Nat. Komun. 4: 2092 doi: 10.1038 / ncomms3092 (2013).

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dopolnilne slike S1-S6, dopolnilne tabele S1-S5, dopolnilne metode in dodatne reference

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.