Za striatalno porazdelitev prenašalca dopamina je potrebno zaporedno vezanje domene cd-pdz | narave komunikacije

Za striatalno porazdelitev prenašalca dopamina je potrebno zaporedno vezanje domene cd-pdz | narave komunikacije

Anonim

Predmeti

  • Nevronska fiziologija
  • Nevrotransmiterji
  • Popravek tega članka je bil objavljen 22. novembra 2013

Ta članek je bil posodobljen

Izvleček

Prenosnik dopamina posreduje ponovni odvzem dopamina iz sinaptične vrzeli. Celični mehanizmi, ki nadzorujejo raven prenašalcev dopamina v striatalnih živčnih terminalih, ostajajo slabo razumljeni. Prenašalci dopamina vsebujejo C-terminalni PDZ (PSD-95 / Disc-large / ZO-1) zaporedje, ki veže domeno, za katerega se verjame, da veže sinaptične proteine, vendar je njegov funkcionalni pomen negotov. Tukaj dokazujemo, da sta dve različni miši za prenašanje dopamina z motenimi motivi vezave PDZ (dopaminski transporter-AAA in dopaminski transporter + Ala) značilni za dramatično izgubo ekspresije transporterja dopamina v striatumu, kar povzroča hiperlokomocijo in oslabljen odziv na amfetamin. V gojenih dopaminergičnih nevronih in progastih rezinah pri miših dopamin transporter-AAA najdemo izrazito zmanjšano površinsko raven prenašalcev dopamina in dokaze za okrepljeno konstitutivno internalizacijo. V nevronih transporterja dopamina-AAA, ne pa pri nevronih divjega tipa, se površinske ravni delno rešijo z izražanjem dominantno-negativne mutacije dinamina (K44A). Naše ugotovitve kažejo, da so interakcije z domeno PDZ kritične za sinaptično porazdelitev prenašalca dopamina in vivo in s tem za pravilno vzdrževanje dopaminske homoeostaze.

Uvod

Dopamin ima pomembno vlogo pri modulaciji motorične aktivnosti, kognicije, nevroendokrinih funkcij in mehanizmov nagrajevanja. Aberantna dopaminergična signalizacija je vključena v več motenj CNS, vključno s shizofrenijo, motnjo hiperaktivnosti s pomanjkanjem pozornosti, odvisnostjo od drog in Parkinsonovo boleznijo 1, 2, 3 . Presinaptični transporter dopamina (DAT) je odgovoren za sekvestiranje sproščenega dopamina iz sinaptične vrzeli 3 . Poleg tega transporter predstavlja glavno tarčo psihostimulantov, kot sta kokain in amfetamin 4 . Karakterizacija miši z genetsko črtanjem izražanja DAT (DAT KO) je pokazala, da je DAT bistven za prostorsko-časovno regulacijo sinaptičnega dopamina. Miši DAT KO kažejo hiperdopaminergično stanje s podaljšanim očistkom dopamina in globokimi spremembami dinamike zunajceličnega dopamina 5 . Vedenjske manifestacije pri miših DAT KO vključujejo lokomotorno hiperaktivnost, endokrini primanjkljaj in oslabljen psihostimulantni odziv 5, 6 .

Še vedno ni razrešeno, kako dopaminergični nevroni zagotavljajo pravilno raven DAT v plazemski membrani presinaptičnih dopaminergičnih terminalov. Nedavna prizadevanja so odkrila več beljakovin, povezanih z DAT, skladno z DAT, ki so del multiproteinske mreže, ki je odgovorna za nadzor nadcelične distribucije DAT 7 . Zanimivo je, da DAT na svojem skrajnem C-koncu vsebuje PDZ (PSD-95 / Disc-large / ZO-1) homologno-vezno zaporedje, ki je dokazano, da veže PDZ domeno PICK1 (protein, ki medsebojno deluje s C-kinazo 1) 8 . PDZ domene so modularne domene medsebojnih beljakovin in beljakovin, ki jih najdemo v odsevnih beljakovinah in za katere je znano, da imajo ključno vlogo pri sestavljanju velikih multiproteinskih kompleksov in pri urejanju trgovine z zavezujočimi partnerji 9, 10, 11 . Medsebojno delovanje med PICK1 in DAT je bilo prvotno predlagano, da je pomembno za izvoz DAT z endoplazemskim retikulumom (ER), ker je C-terminalni odsek DAT povzročil zadrževanje ER in moteno površinsko izražanje DAT v heterolognih celičnih linijah 12 . Vendar smo pozneje pokazali, da PDZ-vezavna zaporedja DAT ni potrebna niti zadostna za površinsko ekspresijo DAT v heterolognih celicah 13 . Tako celični in fiziološki pomen interakcij DAT PDZ in vivo ostajata nejasna.

Tu raziskujemo pomen zaporedja vezave domene CZ za funkcijo DAT in vivo z generiranjem DAT knock-in miši z motenimi zaporedji vezave domene PDZ. Za prekinitev morebitnih interakcij domen PDZ najprej zamenjamo PDZ-ciljno zaporedje (–LLV) z ostanki alanina (DAT-AAA). Motnja ima velike posledice za distribucijo transporterja z 80–90% zmanjšanjem nivoja transporterjev v strijatalnih terminalih dopaminergičnih nevronov, ne da bi to oviralo zlaganje in izvoz ER transporterja. Ta sprememba v distribuciji DAT v skladu z edinstvenimi spremembami dopaminergične signalizacije povzroči pomembne vedenjske spremembe in oslabljeno občutljivost za amfetamin. Nadaljnja podpora za nepogrešljivo vlogo PDZ-vezavne sekvence za strijatalno distribucijo DAT je pridobljena v drugi DAT knock-in miški, v kateri se interakcije PDZ domene prekinejo z dodatkom enega samega C-terminala alanina (DAT + Ala). Izjemno je, da ustreznih sprememb v distribuciji DAT ni opaziti pri izločilnih miših PICK1, ki bi podprle to, da PICK1 ni kritičen za sinaptično distribucijo DAT in vivo .

Rezultati

Mutacija zaporedja PDZ-vezave D-C-terminala

Človeški DAT vsebuje zaporedje vezave PDZ na C-terminalu (−LKV), ki so ga predhodno pokazali drugi preiskovalci in mi, da je sodeloval s PDZ domeno PICK1 8, 13, 14 . Po nadomestitvi alanina zadnjih treh C-terminalnih ostankov pri človeškem DAT (618–620) je bila interakcija prekinjena 13 . Z uporabo fluorescenčnega polarizacijskega testa smo ugotovili, da se mišji DAT C-konec (–LLV) veže tudi na PDIC domeno PICK1 (slika 1a) 14 in da je alaninska zamenjava zaporedja vezave PDZ v mišjem DAT izrazito zmanjšala vezavo afiniteta (WT: K i = 0, 68 µM; DAT-AAA: K i = 20, 1 µM) (slika 1b).

Image

( a ) Shematski prikaz mDAT topologije in C-terminalnih zaporedij za WT DAT in DAT-AAA z alaninsko substitucijo treh C-terminalnih ostankov. ( b ) Fluorescenčni test polarizacijske konkurenčne konkurence na očiščenem PICK1 z uporabo 40 nM Oregonovega zeleno označenega človeškega DAT peptida (13 C-terminalnih ostankov) in povečanje koncentracije označenih neoznačenih peptidov (kar ustreza 13 C-terminalnim ostankom mDAT WT in DAT- AAA). Podatki so vrednosti polarizacije (mP) (pomeni ± sem, n = 3). ( c ) Kvantitativni PCR tkiva srednjega možganov v realnem času z mišmi WT in DAT-AAA ne kaže razlik v nivoju izražanja mRNA. Podatki so prikazani kot vrednosti praga surovega cikla ( C t ) za DAT in TH (pomeni ± sem, n = 4, neparametrični Mann-Whitneyjev test, P > 0, 05). ( d, e ) reprezentativni fotomikrografiji DAT-ir in TH-ir v striatumu (lestvica lestvice = 500 μm) in srednjem možganu (lestvica lestvice = 200 μm) pri miših WT in DAT-AAA. Pri miših DAT-AAA opazimo znatno izgubo DAT-irja, medtem ko TH-ir kažeta podobno intenzivnost v obeh genotipih. ( f ) Za polkvantifikacijo ravni DAT in TH smo uporabili optično denzitometrijo. Srednje vrednosti so bile izračunane in vrednosti mišk, ki so bile izločene, so bile normalizirane na WT (povprečje ± sem, Str = 33%, SN = 81% in VTA = 76% WT, *** P <0, 001, n = 5, ena- način analize variance s post-hoc Bonferronovim večkratnim primerjalnim testom).

Slika v polni velikosti

Zmanjšanje strijatalne porazdelitve DAT pri miših DAT-AAA

Da bi ocenili pomen interakcij domen PDZ za funkcijo DAT in vivo , smo ustvarili mišji sev DAT, ki izraža mutant DAT-AAA namesto WT (dopolnilna slika S1). Uvedba DAT-AAA ni vplivala na transkripcijo gena DAT, to je, da so podobne ravni mRNA bile ugotovljene pri miših DAT-AAA in WT steljah. Ravni mRNA za tirozin hidroksilazo (TH), ključni encim pri sintezi dopamina, in marker dopaminergičnih nevronov, sta bili podobni tudi pri miših WT in DAT-AAA (slika 1c).

Celično porazdelitev DAT-AAA smo ocenili z imunohistokemijsko karakterizacijo. DAT-imunoreaktivnost (DAT-ir) je bila lokalizirana pretežno na hrbtnem / ventralnem striatumu, olfaktornih tuberklih in srednjem možganu (substantia nigra (SN) ter na ventralnem tegmentalnem območju (VTA)) (slika 1d), kar potrjuje prejšnja poročila 15, 16 . Kot smo pričakovali, smo opazili močan DAT-ir aksonskih terminalov v striatumu WT miši, medtem ko so DAT-AAA miši pokazale izjemno izgubo DAT-ir. V nasprotju s tem pa je imunoznačevanje TH pokazalo gosto obarvanje aksonskih vlaken v striatumu s podobno intenzivnostjo v obeh genotipih (slika 1d).

V ventralnem srednjem mozgu so opazili DAT-ir pri perikariji in ekstenzijah mišk WT in DAT-AAA; vendar so, kot v striatumu, mišje DAT-AAA pokazale zmanjšano gostoto v SN in VTA, zlasti kar ustreza dendritom (slika 1e). TH imuno označevanje je še enkrat pokazalo intenzivno označevanje perikarije in procesov v obeh genotipih (slika 1e). Presenetljivo je kvantitativno določanje imunoreaktivnosti pokazalo, da se je DAT-ir v striatumu iz mišjih DAT-AAA zmanjšal na ~ 30% WT, medtem ko sta SN in VTA pokazala manj izrazit padec (SN ~ 81% in VTA 76% WT) (sl. 1f). Ogromna izguba DAT-ir vlaken pri miših DAT-AAA je bila poudarjena v sagitalnem pogledu, pri čemer so prikazane projekcije srednjega možganov, ki sevajo v končna polja striatuma (dopolnilna slika S1). Kvantifikacija TH-ir ni pokazala pomembne razlike med genotipi (slika 1f).

Imunoblotiranje pripravkov progaste membrane je potrdilo, da so se ravni DAT v miših DAT-AAA dramatično zmanjšale, medtem ko je skupni TH protein praktično nespremenjen (slika 2a). Raven funkcionalne DAT v progastih membranah smo raziskovali v poskusih z vezavo radioligand z ligandom DAT [ 125 I] -RTI-55. Število maksimalnih vezavnih mest ( B max ) se je zmanjšalo na ~ 10% WT brez spremembe afinitete (slika 2b). Avtoradiografijo smo izvedli tudi z ligandom DAT, [3H] -mazindol. Medtem ko so WT mišje imele precejšnjo gostoto mest, ki se vežejo na DAT, tako v striatumu kot v srednjem mozgu, očitno ni bilo vezave [3H] -mazindol tako v striatumu kot v srednjem možganu miši DAT-AAA (sl. 2c). Upoštevajte, da je občutljivost avtoradiografije [3H] -mazindol verjetno nižja od občutljivosti [ 125 I] -RTI-55. To lahko razloži odsotnost [3H] -mazindol vezave pri miših DAT-AAA. Ravni funkcionalne DAT v striatumu so prav tako obravnavali z vrednotenjem [3H] -dopamina v strijatalnih sinaptosomih. Na miših DAT-AAA so bile prikazane obsežne, vendar ne popolne izgube sposobnosti privzema (slika 2e). Nazadnje smo količinsko opredelili količino površinsko eksprimiranih transporterjev s površinsko biotinilacijo v progastih rezinah, kjer so bile vrednosti DAT-AAA znižane na ~ 8% ravni WT (slika 2f). Če povzamemo, naši podatki kažejo izrazito znižanje nivojev DAT v miših DAT-AAA, brez spremenjene aktivnosti prisotnih transporterjev.

Image

( a ) Imunobloting je potrdil veliko izgubo izražanja DAT v striatumu, medtem ko so ravni TH podobne kot WT. Zgornje plošče, denzitometrična analiza imunoblotov za miši WT in DAT-AAA, * P <0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test (pomeni ± sem, n = 4). Spodnje plošče, reprezentativni imunobloti za DAT (levo) in TH (desno) v strijčnih lizatih iz mišk WT in DAT-AAA. ( b ) Preizkusi vezave konkurence na progastih membranah z visokim afinitetnim DAT ligandom [ 125 I] -RTI-55. Podatki so normalizirani na WT krmiljenju odpadkov ( n = 4). [ 125 I] -RTI-55 vezavo smo analizirali z nelinearno regresijsko analizo z uporabo GraphPad Prism 5.0. Konstante afinitete ( K i ) smo določili ob predpostavki vezave na enem mestu. Vsebnosti B max in Kd sta bili dobljeni iz vrednosti polovične zaviralne koncentracije (IC50), ocenjene s predpostavko sigmoidne krivulje na enem mestu (eno mesto - Fit LogIC50). B max : WT, 290 ± 50 fmol na μg beljakovin; DAT-AAA, 30 ± 6, 2 fmol na μg beljakovin (pomeni ± sem, n = 4); Kd : WT, 0, 127 (0, 105–0, 154) nM; DAT-AAA, 0, 334 (0, 108–1, 062) nM (pomeni (interval sem), n = 4). ( c, d ) [3H] -mazindol avtoradiografija kaže visoko gostoto mest, ki se vežejo na DAT, v striatumu pri miših WT, medtem ko je pri miših DAT-AAA vezava odsotna (pomeni ± sem, n = 4). Področje srednjega možganov kaže nižjo gostoto vezivnih mest v WT, vezava pa je praktično odsotna pri miših DAT-AAA. ( e ) Obsežna izguba [ 3 H] -dopamina (0, 125 µM) v striptiznih sinaptosomih iz DAT-AAA miši v primerjavi z WT, * P <0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test (pomeni ± sem, n = 4– 5). ( f ) Površinsko biotinilacija progastih rezin kaže dramatično izgubo površinsko izraženega DAT pri miših DAT-AAA (% WT-kontrole ± sem, en-vzorec t- test, n = 3, *** P <0, 001).

Slika v polni velikosti

Obsežna izguba DAT-a v sinaptičnih terminalih iz DAT-AAA

Konfokalno slikanje progastih odsekov na miših WT je pokazalo obsežno mrežo aksonalnih terminalov, označenih z DAT, v striatumu s pravokotnim vzorcem, razen na območjih, kjer so posegali bela snov in nevronske perikarije (slika 3). Snemanje progastih odsekov z miših DAT-AAA je pokazalo vidno izgubo aksonskih terminalov, označenih z DAT. V nasprotju s tem je bil vzorec označevanja TH podoben pri miših WT in DAT-AAA, kar je pokazalo intenzivno obarvanje terminalov z vzorcem puntačnega označevanja filamentov, ki se delno prekrivajo z DAT (slika 3a). DAT-ir v SN od mišov DAT-AAA je bil večinoma lokaliziran v perikarijo, kjer je bila intenzivnost podobna kot pri WT. Nevronski procesi pa so pokazali omejeno označevanje pri miših DAT-AAA, medtem ko so podrobne mikrografije WT miši pokazale razbito, kompleksno mrežo dendritov. Imunofluorescentno označevanje TH WT srednjih možganskih nevronov se je pokazalo znatno prekrivanje z DAT in miši DAT-AAA so pokazale podoben vzorec TH-ir kot WT miši (sl. 3c).

Image

( a ) Aksonski terminali v striatumu, označeni za DAT (zelena, Alexa-488), kažejo gosto DAT-ir pri miših WT, medtem ko miši DAT-AAA kažejo skoraj popolno izgubo DAT-ir. So-lokalizacija s TH (rdeča, Alexa-568) kaže na delno prekrivanje tako pri miših WT kot DAT-AAA. Porazdelitev TH kaže na podobno intenzivnost v obeh genotipih s tipičnim točnim vzorcem. ( b ) Večje povečave na miših WT kažejo značilno punktatno DAT označevanje presinaptičnih terminalov v striatumu, medtem ko pri miših DAT-AAA opažamo omejeno porazdelitev. ( c ) Telesa nevronskih celic v SN iz mišic WT kažejo intenziven DAT-ir tako v celicah soma kot tudi v podaljških, medtem ko je označevanje na miših DAT-AAA omejeno predvsem na območje soma celic. TH-ir prikazuje izrazito označevanje nevronov srednjega možganov pri miših WT in DAT-AAA. ( d ) Večje povečave od srednjih možganov WT in DAT-AAA. Vse lestvice, 10 μm.

Slika v polni velikosti

Spremenjeno vedenje DAT-AAA miši

Vedenjske in fizične značilnosti eksperimentalno naivnih miši so bile ocenjene s primarnim zaslonskim postopkom SHIRPA, ki obsega več ukrepov, ki zajemajo različne reflekse in osnovne senzimotorne funkcije (dodatna tabela S1) 17 . Da bi razkrili specifične vedenjske posledice mutacije, smo testirali bazalno lokomotiranje in hiperaktivnost, ki jo povzroča amfetamin. V prvih 90 minutah 4-urnega testiranja so bile miši DAT-AAA hiperaktivne, v primerjavi z mišmi WT (slika 4a). Hiperaktivnost so opazili tudi po injiciranju fiziološke raztopine (slika 4b). Kot je bilo pričakovano, so se WT mišice na zdravljenje z ip amfetaminom (1, 2 ali 3 mg kg -1 ) odzvale z znatno hiperaktivnostjo, medtem ko so mišje DAT-AAA pokazale oslabljen odziv amfetamina brez pomembnih sprememb v lokomotorni aktivnosti (slika 4b). Preizkusili smo tudi učinek amfetamina 2 mg kg -1 ip v miših DAT-AAA po 2, 5 h navadi v škatlah aktivnosti. Ponovno ni bilo pomembnega učinka amfetamina pri miših DAT-AAA, medtem ko je odmerek 2 mg kg -1 povečal aktivnost WT (slika 4c). V skladu z ugotovitvami v poljih aktivnosti so mišje DAT-AAA pokazale povečano lokomotorno aktivnost v testu na odprtem terenu, ocenjenem kot prevoženo skupno razdaljo (slika 4d).

Image

( a ) Štiri ure osnovnega gibanja. Miše smo postavili v polje za aktivnost in lokomotiranje smo izmerili kot skupni prelom snopa v 30 min zabojnikov. Podatki so povprečje ± sem, * P <0, 05, *** P <0, 001, Bonferroni post-hoc t- preskusi po pomembnosti v dvosmerni analizi variance (ANOVA), F (7, 175) = 7, 5; P <0, 001; n WT = 14, n AAA = 13. ( b ) hiperaktivnost, ki jo povzroča amfetamin. Lokomotiranje je bilo ocenjeno kot skupno prekinitev žarka v 1 uri. Podatki so povprečje ± sem, # P <0, 05 v primerjavi z ustreznimi WT, Bonferroni post-hoc t- preskusi po pomembnih dvosmernih ANOVA, F (3, 91) = 5, 58; P <0, 01 *** P <0, 001 v primerjavi z lastno fiziološko raztopino po pomembni enosmerni ANOVA; WT ( F (3, 26) = 23, 5; P <0, 001); n WT = 7–9, n AAA = 9–10. ( c ) Hiperaktivnost, ki jo povzroča amfetamin, po navadi. Lokomotorna aktivnost je prikazana kot skupni prekinitev žarka med 2, 5 h (povprečje ± sem), # P <0, 05 v primerjavi z ustreznim WT, Bonferroni post-hoc t -testi po pomembnih dvosmernih ANOVA, F (1, 27) = 11, 12; P <0, 01 *** P <0, 001 glede na lastno fiziološko raztopino, Študentov t- test v primerjavi z WT / fiziološko raztopino, t (11) = 5, 88, n WT = 6–7, n AAA = 9. ( d ) Bazalno gibanje na prostem v 30 minutah. Miške smo postavili v sredino odprtega polja in lokomotirali smo izmerili kot premik celotne razdalje. Podatki so pomeni ± sem, ** P <0, 01, t (19) = 3, 4; n WT = 11, n AAA = 10.

Slika v polni velikosti

Površinska ekspresija DAT-AAA se zmanjša v dopaminergičnih nevronih

Za raziskovanje celičnega fenotipa DAT-AAA smo pripravili postnatalne kulture srednjih možganov dopaminergičnih nevronov. Imunoobčutljivosti WT nevronov so pokazale široko porazdelitev DAT-irja v nevronskih podaljških, varikozitetah in perikariji (slika 5a). Imunosignal je bil izrazito zmanjšan v nevronih DAT-AAA in je bil videti bolj lokaliziran v somih (slika 5a), kar je skladno z vzorcem DAT-obarvanja, ki smo ga opazili v odsekih srednjega možganov DAT-AAA (slika 3c). Vendar pa je bilo nekaj DAT-ir očitno prisotnih tudi v nevronskih končnicah.

Image

( a ) Vizualizacija DAT v dopaminergičnih nevronih pri miših WT in DAT-AAA z imunološko obarvanjem in konfokalno mikroskopijo. Intenzivnost označevanja DAT-AAA se je močno zmanjšala v primerjavi z WTDAT. Označevanje je bilo najbolj intenzivno pri somasih, vendar je bil DAT-AAA očitno prisoten tudi v podaljških. Slike so reprezentativno obarvanje treh neodvisno pripravljenih kultur. ( b ) Konfokalno slikanje nevronov srednjega možganov, pridobljenih iz mišic WT ali DAT-AAA. Nevrone smo obarvali s fluorescentnim analogom kokaina, JHC 1–64 (10 nM), da smo dobili specifično označevanje endogeno izraženih WT in DAT-AAA, prisotnih v plazemski membrani. Nevroni miši DAT-AAA so imeli izrazito zmanjšano površinsko označevanje. Slike so reprezentativne za tri neodvisno pripravljene kulture. Tehtnice, 10 μm. ( c ) Imunoblotiranje membranskih frakcij, pridobljenih iz celih možganov novorojenih mladičev (P1 – P3). Leva plošča, reprezentativni imunoblot. V membranskih frakcijah tako mladičev kot WT in DAT-AAA se odkrije en pas DAT (~ 70 kDa), čeprav z izrazito zmanjšano intenzivnostjo za DAT-AAA. Upoštevajte, da v nobenem genotipu niso bili odkriti nezreli pasovi DAT. Desna plošča, denzitometrična analiza imunoblotov, prikazana kot% WT, pomeni ± sem, ** P <0, 01, en-vzorec t- test. ( d ) Endo H in PNGase F zdravljenje nevronskih lizatov. Imunoblotiranje lizatov iz gojenih dopaminergičnih nevronov prav tako kaže, da neobdelani lizati povzročijo en sam DAT-pas (~ 70 kDa), tako za WT kot za DAT-AAA, brez zaznanih nezrelih pasov. Tako WT kot DAT-AAA pasovi niso občutljivi na zdravljenje z Endo H, vendar eluira pri ~ 45 kDa po deglikozilaciji s PNGase F ( n = 3).

Slika v polni velikosti

Za vizualizacijo površinsko izraženega DAT smo izkoristili naš nedavno razviti fluorescentni analog kokaina JHC 1–64, ki je omogočil označevanje pravilno zloženega transporterja v plazemski membrani živih nevronov 18 . Kot smo že poročali pri podganjih nevronih 18, smo v mišjih nevronih WT opazili specifičen fluorescenčni signal z enakomerno porazdelitvijo v plazemski membrani perikarije in razširitev (slika 5b). Označevanje nevronov, pridobljenih z DAT-AAA, je pokazalo manj intenzivnosti obarvanja, kar je skladno s pomembnim zmanjšanjem površinske izraženosti DAT-AAA.

Nato smo izvedli poskuse imunoblotiranja na celičnih lizatih dopaminergičnih nevronov, pa tudi na frakcijah celotnih možganskih membran WT in DAT-AAA mladičev (P1 – P3). V celotnih možganskih lizatih sta tako WT DAT kot DAT-AAA eluirala kot en-70-kDa pas brez zaznavanja manjših nezrelih glikoform (Slika 5c). Podobni rezultati so bili dobljeni iz celih možganskih membran pri odraslih miših WT in DAT-AAA (podatki niso prikazani). Bistveno znižana intenzivnost pasu DAT-AAA je potrdila, da se raven DAT-AAA močno zmanjša že na dan poporodnega dne 1–3 (slika 5c). Transporter je tudi eluiral kot en-70 kDa pas v lizatih iz gojenih nevronov, kar ustreza glikoziliranemu DAT s celotno dolžino (slika 5d). Da preverimo, ali ta pas DAT ustreza zreli, popolnoma glikozilirani DAT, smo nevronske lizate obdelali z endoglikozidazo H (Endo H) ali peptidno N-glikozidazo F (PNGase F). Endo H selektivno cepi ER glikoformne glikoproteine, medtem ko PNGase F cepi vse oligosaharide, povezane z asparaginom. Zdravljenje z endo H ni imelo učinka, kar kaže na to, da je bil zaznavni DAT preprodajal zunaj ER (slika 5d in dodatna slika S2 za pozitiven nadzor Endo H). Nasprotno in v dogovoru z zrelo glikozilacijo je zdravljenje z PNGase F odstranilo 70-kDa pas in namesto tega vzpostavilo pas približno 45 kDa, ki najverjetneje ustreza popolnoma deglikoziliranemu transporterju (slika 5d).

Elucija DAT kot enega samega, zrelega pasu nasprotuje preprostemu zadrževanju ER, kar povzroči moteno sinaptično porazdelitev DAT-AAA. Da bi izključili možnost, da bi lahko zaradi nezrelega ER-obdržanega DAT-AAA hitro propadla proteosomalna degradacija, ki preprečuje odkrivanje nezrelih oblik, nevronske kulture obdelali s proteosomskim zaviralcem, MG-132. To zdravljenje ni povzročilo zaznavanja nezrelih ne-glikoziliranih pasov (dopolnilna slika S2). Dodatni poskusi na transficiranih heterolognih celicah so se nadalje zagovarjali proti zadrževanju ER DAT-AAA. Po transfekciji tako celic HEK293 kot celic N2A smo opazili enakovredno [3H] -dopaminsko absorpcijsko zmogljivost ( V max ) tako za WT kot DAT-AAA, brez očitne razlike v vrednostih K m (dodatna slika S3). To se strinja z našimi prejšnjimi opažanji pri človeškem DAT-AAA 13 in je v nasprotju z učinkom C-terminalnih oklepov, za katere je znano, da povzročajo zadrževanje ER 8, 12, 13, 19 . Opazno to kaže, da pomena C-terminalnega PDZ-vezavnega zaporedja ni mogoče reproducirati v heterolognih ekspresijskih sistemih. Skupaj sklepamo, da izguba DAT-AAA v sinaptičnih terminalih verjetno ne bo posledica napačnega zlaganja in zadrževanja ER.

Povečana internalizacija DAT-AAA v dopaminergičnih nevronih

Možna razlaga za dramatično izgubo strijnega DAT pri miših DAT-AAA je zmanjšanje površinske stabilnosti DAT-AAA, kar vodi do večje internalizacije in razgradnje lizosoma. Konstitutivna internalizacija DAT je bila dokazana tako v okuženih heterolognih celicah kot v dopaminergičnih nevronih 20, 21, 22 . Za oceno konstitutivne internalizacije smo uporabili fluorescentni analog kokaina JHC 1–64, ki ne vpliva na trgovino z DAT in ima zelo počasno hitrost, zaradi česar je primeren za preučevanje internalizacije DAT 18 . Površinsko izražen DAT je bil označen z JHC 1–64 pri 4 ° C, ki mu je sledila 1-urna internalizacija pri 37 ° C. Internalizirana, JHC 1–64-označena DAT je bila vidna kot različne znotrajcelične vezikularne strukture tako v DAT-AAA kot v WT nevronih. Teh struktur pri kontrolah pri 4 ° C nismo opazili (slika 6a). Ponašanje je bilo očitno, da ustreza somam in njihovim proksimalnim podaljškom, čeprav jih je pri distalnih tankih podaljških težje prepoznati. Zanimivo je, da se je konstitutivna ponotranjenost pojavila intenzivno pri številnih nevronih DAT-AAA v primerjavi z nizko intenzivnostjo površinskega označevanja. V skladu s tem smo količinsko opredelili internalizirano frakcijo in potrdili, da je bil bistveno večji delež DAT-AAA ponotranjen v primerjavi z WT DAT (slika 6b). Prej smo pokazali, da konstitutivno internalizirani WT prednostno razvršča lizosome pri dopaminergičnih nevronih podgane 23 . Da bi raziskali usodo internaliziranega DAT-AAA, smo v prisotnosti lizosomskega markerja LysoTracker prikazali internalizirano JHC 1-64 z oznako DAT. Tako internalizirani DAT-AAA kot WTDAT sta pokazali znatno ko-lokalizacijo z LysoTracker, kar kaže, da je tudi večina internaliziranih DAT-AAA najverjetneje razvrščena po degradaciji (slika 6d).

Image

( a ) Vizualizacija konstitutivne internalizacije DAT v WT in DAT-AAA nevronih s konfokalnim slikanjem v živo s fluorescentnim analogom kokaina, JHC 1–64. Leve plošče, površinsko izražen DAT, smo označili z inkubacijo nevronov z 10 nM JHC 1–64 pri 4 ° C, nato pa 1-urno inkubacijo pri 37 ° C, da smo omogočili internalizacijo. Srednje plošče, prenos slike. Desne plošče, 4 ° C nadzor temperature za internalizacijo. Fluorescenca je prikazana na sivi lestvici z najvišjo fluorescenco, ki jo predstavljajo najtemnejši sliki. Internalizacija kompleksov DAT / JHC 1–64 je v JHC 1-64-pozitivnih vezikularnih strukturah v nevronskih somah in proksimalnih podaljških. Pod kontrolnimi pogoji 4 ° C se podobni JHC 1-64-pozitivni vezikli niso pojavili. Prikazane slike so posnete z enakimi nastavitvami za vizualizacijo intenzitete JHC 1–64 pod enakimi pogoji za WT in DAT-AAA nevrone. ( b ) Kvantifikacija internaliziranega DAT. Količino internaliziranih DAT smo količinsko opredelili glede na skupno količino DAT z oznako JHC 1-64 in pokazali, da je bil bistveno večji delež DAT internaliziran v nevronih DAT-AAA ( n = 20 nevronov) v primerjavi z WT nevroni ( n = 30 nevronov), pomeni ± sem, * P <0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test. ( c ) Površinsko biotiniliranje progastih rezin. Strijatalne rezine so biotinilirane po 1 h inkubaciji pri 37 ° C, da se omogoči internalizacija, ali pri 4 ° C, nadzor nad nekontrolirano temperaturo. Zgornja in srednja plošča, reprezentativni bloti WT in DAT-AAA lizati, v tem zaporedju. Lizati iz miših DAT-AAA in WT so bili uporabljeni na ločenih gelih, da se omogoči boljša vizualizacija pasu DAT-AAA, ne da bi dosegli nasičene ravni intenzivnosti pasu WT. Spodnja plošča, količinsko določitev internaliziranih frakcij, to je zmanjšanje površinske ravni. Internalizirana frakcija je bila bistveno večja pri rezinah DAT-AAA, pomeni ± sem, * P <0, 05, enorezen t- test, n = 3. ( d ) So-lokalizacija med konstitutivno internaliziranimi kompleksi JHC 1–64 / DAT in LysoTracker-jem. Za WT DAT in DAT-AAA je opaziti veliko ko-lokalizacije z LysoTracker-jem. Tehtnice, 10 μm.

Slika v polni velikosti

Da bi pridobili nadaljnjo podporo za boljšo internalizacijo DAT-AAA, smo racionalizirali, da se v strijčastih rezinah strijatalni dopaminergični terminali odklopijo od somas in s tem od nenehne oskrbe na novo sintetiziranega DAT. To bi nam moralo omogočiti zaznavanje domnevnega zmanjšanja nivoja površinske faze DAT, ki je posledica konstitutivne prerazporeditve transporterja stran od površine. Dejansko je, kot je bilo ocenjeno s površinskim biotinilacijskim protokolom, v rezinah po 1 h inkubacije pri 37 ° C mogoče zaznati zmanjšanje površinske ravni WT in DAT-AAA v primerjavi z inkubacijo pri nedopustni temperaturi, ki trguje s prometom (4 ° C kontrola ) (Slika 6c). Pomembno je bilo, da je bilo zmanjšanje (označeno kot internalizirana frakcija) razmeroma večje pri strižnih rezinah DAT-AAA (slika 6c), skladno z našimi ugotovitvami na gojenih nevronih. Tako ima DAT-AAA večjo prerazporeditev na citosolne oddelke med pogoji, ko je dovod transporterja na površino omejen na medcelični bazen, prisoten v terminalih na začetku eksperimenta.

Zaviranje endocitoze reši površinsko izražanje DAT-AAA

Hipotetizirali smo, da če DAT-AAA podvrže pospešeni endocitozi, bi zaviranje te konstitutivne endocitoze moralo rešiti površinske ravni DAT-AAA. Izkazalo se je, da je konstitutivna internalizacija DAT odvisna od katrina / dinamina 18, 20 . Zato smo zavirali endocitozo z uporabo dominantno negativnega dinamina mutanta, K44A, za katerega je bilo predhodno dokazano, da zmanjšuje internalizacijo DAT 18, 24 . WT ali K44A dinamin sta bila izražena v dopaminergičnih nevronih z uporabo rekombinantnih lentivirusnih vektorjev, transducirani nevroni pa so bili identificirani s sočasno izražanjem povečanega zelenega fluorescentnega proteina (EGFP). Čeprav je bila učinkovitost transdukcije visoka, je bilo mogoče prepoznati le nekaj transduciranih dopaminergičnih nevronov, kar je poudarilo splošne težave pri doseganju heterologne ekspresije v teh nevronih. Kljub temu pa je skrbno slikanje v konfokalnem postopku v živo po označevanju s kokainskim analogom JHC 1–64 za oceno ravni transporterjev dovoljeno identificirati več transduciranih dopaminergičnih nevronov. Slikovna analiza je predlagala povečanje površinskega signala JHC 1–64 v nevronih DAT-AAA, transduciranih s K44A, v primerjavi z nevroni, transducirani z WT dinaminom (slika 7a-d). To je bilo potrjeno s količinsko določitvijo površinskega signala z izračunom povprečne intenzitete JHC 1-64 označevanja soma in proksimalnih podaljškov glede na kontrolne nevrone. To je pokazalo znatno povečanje relativnega površinskega signala DAT-AAA v nevronih, ki izražajo K44A, medtem ko pri WT nevronih ni bilo zaznati učinka K44A (slika 7a-d).

Image

( a ) Dopaminergični nevroni v srednjem možganu, pridobljeni iz WT mladičev, so bili transducirani na dan 1–3 in vitro z lentivirusom, ki kodira bodisi WT dinamin bodisi prevladujoče negativni mutant dinamina K44A, oba skupaj z ekspresijo EGFP. Leve plošče, JHC 1–64 označevanje (10 nM) površinsko izraženega DAT, opravljene 8–10 dni po transdukciji, da bi ocenili učinek zaviranja internalizacije DAT na površinsko izražanje. Srednje plošče, signal EGFP. Desne plošče, prekrivanje kanalov. ( b ) Kvantifikacija fluorescence JHC 1–64 ni pokazala nobene razlike med WT in K44A prenašalcem dinamina WT nevronov, pomeni ± sem ( n = 34 in 38 nevronov za WT dinamin in dinamin-K44A). ( c ) Srednji možganski dopaminergični nevroni, pridobljeni iz mladičev DAT-AAA, transducirani z lentivirusom, ki kodira bodisi WT dinamin bodisi prevladujoče negativni mutant dinamina K44A. Leve plošče, JHC 1–64 oznake (10 nM) površinsko izraženega DAT. Srednje plošče, signal EGFP. Desne plošče, prekrivanje kanalov. ( d ) Inhibicija internalizacije, odvisne od dinamina, z dinaminom K44A, v nevronih DAT-AAA je privedla do občutnega povečanja povprečne intenzivnosti JHC 1–64 glede na kontrolne nevrone, transducirane z dinaminom WT ( n = 25 in 26 nevronov za dinamina WT oziroma K44A, * P <0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test). Prikazane slike izvirajo iz najmanj petih neodvisnih obarvanj iz vsaj štirih neodvisnih nevronskih pripravkov. Vse slike določenega genotipa so posnete z enakimi nastavitvami za odkrivanje JHC 1–64. Tehtnice, 10 μm.

Slika v polni velikosti

Fenotipi DAT-AAA in DAT + Ala niso odvisni od PICK1

Imunoreaktivnost DAT in TH smo raziskovali tudi v dodatnem DAT-u za sev, DAT + Ala, kjer je dodajanje alanina v C-terminus motilo interakcije s proteini domene PDZ (dopolnilna slika S4). Miše DAT + Ala so pokazale podobno, čeprav manj izrazito zmanjšanje strijatalnega DAT-a, sočasno z zmanjšanim označevanjem nevronskih procesov v srednjem možganu. TH-ir je pokazal podobno intenzivnost na dopaminergičnih območjih pri miših WT in DAT + Ala. Imunobloting je potrdil znižanje ravni DAT v striatumu DAT + Ala miši (slika 8a-d). Da bi ugotovili, ali imajo miši DAT + Ala podoben vedenjski fenotip kot miši DAT-AAA, smo v testu na odprtem terenu raziskali bazalno lokomotorno aktivnost. Dejansko so mišje DAT + Ala pokazale povečano bazalno gibanje v primerjavi z WT (slika 8e). Za oceno, ali je fenotip miši DAT-AAA in DAT + Ala povezan s prekinitvijo interakcije s PICK1, smo karakterizirali porazdelitev DAT-ir v PICK1 knock-out miših (PICK KO). DAT-ir se pri teh miši ni zmanjšal, niti v striatumu niti v srednjem možganu. To ugotovitev je bila potrjena tudi z imunoblotingom (slika 8f – i). V skladu s tem se miši PICK1 KO pri testu na prostem niso razlikovale od WT (slika 8j). Tako PICK1 ni potreben za aksonsko distribucijo DAT v striatumu in vivo .

Image

( a, b ) Reprezentativni fotomikrografiji DAT-ir in TH-ir v striatumu in srednjem možganu pri miših WT in DAT + Ala kažejo znatno izgubo DAT-ir pri mutiranih miših, medtem ko TH-ir kaže podobno intenzivnost med obema genotipoma. ( c ) Zgornje plošče, konfokalni mikrografijo aksonskih sponk v WT in DAT + Ala trakastih rezinah z oznako DAT. Spodnje plošče, oznaka DAT na rezinah srednjih možganov. Tako striatum kot srednji možgan kažeta na veliko izgubo DAT-irja pri miših DAT + Ala. Srednji možganski nevroni v WT kažejo obsežno označevanje DAT tako v celičnih telesih kot na dendritih, medtem ko je pri miših DAT + Ala označevanje zmanjšano in omejeno na perikarijo. ( d ) Imunobloting strijatalnih lizatov potrdi znižanje ravni DAT v striatumu DAT + Ala. Leva plošča, denzitometrična analiza imunoblotov, pomeni ± sem, n = 4, * P <0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test. Desna plošča, reprezentativni imunobloti. ( e ) 30 min bazalne gibljivosti pri testu na prostem. Miške smo postavili v sredino odprtega polja in lokomotirali smo izmerili kot premik celotne razdalje. Podatki so pomeni ± sem, *** P <0, 001, t (19) = 5, 0; n WT = 10, n + Ala = 11. ( f, g ) Reprezentativni fotomikrografi na miših PICK1 WT in KO kažejo nedotaknjene DAT- in TH-ir na dopaminergičnih območjih pri mišjih KO. ( h ) Zgornje plošče, konfokalne mikrografije aksonskih sponk v progastih rezinah mišk WT in PICK1 KO z oznako DAT. Spodnje plošče, oznaka DAT na rezinah srednjega možganov WT in PICK1 KO. Gosto označevanje DAT je razvidno tako v striatumu kot v srednjem možganu obeh genotipov. ( i ) Imunobloting prikazuje podobne strijatalne ravni DAT tako pri miših WT kot PICK1 KO. Leva plošča, denzitometrična analiza imunoblotov miši WT in PICK1 KO, pomeni ± sem, n = 4, P > 0, 05, neparametrični Mann-Whitneyjev test. Desna plošča, reprezentativni imunobloti. ( j ) 30 min bazalne gibljivosti pri testu na prostem. Miške smo postavili v sredino odprtega polja in lokomotirali smo, ko je bila celotna razdalja premaknjena. Podatki so pomeni ± sem, P = 0, 34, t (44) = 1, 0; n WT = 27, n PICK1 KO = 19. Lestvice: a, f = 500 μm; b, g = 200 μm; c, h = 10 µm.

Slika v polni velikosti

Diskusija

Za oceno fiziološkega pomena C-terminala PDZ-vezanega motiva za delovanje DAT in vivo smo ustvarili DAT-ove nove miši z modificiranimi C-terminini (DAT-AAA in DAT + Ala), ki niso sposobne interakcije s proteini domene PDZ. Pri DAT-AAA smo opazili dramatično znižanje nivoja DAT na površini v strijatalnih presinaptičnih terminalih, ki je verjetno deloma izviralo iz izboljšane konstitutivne endocitoze prenašalca. Poleg tega smo ugotovili, da zmanjšana strijatalna porazdelitev DAT vodi do edinstvenih vedenjskih sprememb, za katere so značilne lokomotorna hiperaktivnost in oslabljen amfetaminski odziv. Te ugotovitve prvič nakazujejo ključno vlogo specifičnih interakcij beljakovin in beljakovin za sinaptično porazdelitev DAT in vivo .

Mutacije beljakovin pogosto poslabšajo zlaganje, kar vodi do zastajanja ER in proteosomske razgradnje 25 . Pokazalo se je, da so odseki C-terminalov povzročili zadrževanje ER človeškega DAT-a v heterolognih celicah 8, 12, 19 in domnevali so, da je vezava PICK1 na DAT-C-konec kritična za izvoz ER in površinsko izražanje DAT 8 . Mutacijska analiza človeškega C-terminala DAT je pokazala, da čeprav je C-terminal ključen za ustrezen izvoz ER, interakcije PDZ verjetno ne bodo vključene 13 . Naša današnja analiza mišjega DAT-AAA v heterolognih celicah je še dodatno podkrepila te ugotovitve (dopolnilna slika S3). Poleg tega pričujoča analiza miš na DAT-AAA in DAT + Ala nasprotuje vlogi PDZ-vezanega motiva pri izvozu ER in vivo , kljub dramatičnemu zmanjšanju strijatalnih ravni DAT. Znano je, da slabo zloženi in ER-zadržani mutanti DAT povzročijo nezrele glikozilirane DAT oblike, občutljive na Endo H 13 . Vendar pri miših WT in DAT-AAA nismo mogli zaznati nobenih nezrelih glikoziliranih oblik DAT v celotnih možganskih izvlečkih, pa tudi v izvlečkih iz gojenih dopaminergičnih nevronov. Takšne oblike se sploh niso pojavile, ko smo kulture zdravili s proteosomskim inhibitorjem MG-132 (dopolnilna slika S2). Verjamemo, da DAT-AAA ni zadržan v zaznavnih količinah, ampak ga odobrijo celični stroji za nadzor kakovosti in dovolijo promet zunaj ER.

Prejšnje študije so pokazale, da je DAT podvržen konstitutivni in regulirani internalizaciji in da bi lahko bil C-terminalni rep vključen v urejanje te trgovine z ljudmi 7, 20, 26 . Skladno s tem smo domnevali, da je bilo opaženo zmanjšanje sinaptičnega in skupnega DAT-AAA vsaj deloma rezultat zmanjšane površinske stabilnosti prenašalca in povečane konstitutivne endocitoze, čemur je sledila lizosomska razgradnja. Pomembno je, da smo z uporabo fluorescentnega analoga kokaina JHC 1–64 (ref. 7, 20) z znakom povečanja konstitutivne endocitoze DAT-AAA v primerjavi z WTDAT v obeh strijatalnih rezinah, s površinsko biotinilacijo in v živih dopaminergičnih nevronih. Naši podatki so tudi pokazali, da je zaviranje konstitutivne endocitoze z izražanjem dominantno negativnega dinamina mutanta K44A privedlo do delnega reševanja DAT-AAA (sliki 6 in 7). No effect was seen for WTDAT possibly because of the much higher expression and thereby different balance between membrane insertion and internalization as compared with DAT-AAA. Finally, we found, in agreement with our previous findings 23, a pronounced co-localization between LysoTracker and internalized WTDAT or DAT-AAA (Fig. 6), supporting that the majority of both internalized DAT and DAT-AAA is sorted to lysosomal degradation 23 . Correspondingly, DAT-AAA and WTDAT co-localized in part with the lysosomal marker LAMP1 in midbrain stainings (Supplementary Fig. S5). Although internalized DAT can undergo recycling 7, 20, 27, it seems therefore reasonable to suggest that enhanced internalization and subsequent rapid degradation contribute to the DAT-AAA phenotype observed in vivo as well as ex vivo. Future studies should assess whether additional mechanisms contribute to the observed phenotypes, for example, we cannot exclude that a fraction of synthesized DAT-AAA is missorted and never reaches the presynaptic terminals before it is internalized and degraded in the somatodendritic compartment.

In addition to regulating compartmentalization and targeting 28, 29, 30, PDZ domain-mediated protein–protein interactions have previously been suggested to regulate surface stability of membrane proteins 31, 32, 33 . Reduced protein expression, but normal synaptic localization, was reported for knock-in mice lacking the PDZ-ligand motif of the metabotropic glutamate receptor mGluR7a, and hypothesized to be caused by increased turnover and degradation, in absence of stabilizing PDZ interactions 34 . It has also been suggested that the postsynaptic scaffolding protein, PSD-95, stabilizes the glycine transporter and the Kv1.4 potassium channel at the plasma membrane 31, 33 .

PICK1 is the only PDZ domain protein known to bind the DAT C-terminus and the interaction has been addressed in several studies 8, 13, 14, 35 . However, the present data show that the dramatic phenotype observed in both DAT-AAA and DAT+Ala mice is not observed in PICK1 KO mice, arguing that PICK1 is not responsible for maintaining DAT levels in dopaminergic nerve terminals. A remaining challenge is to identify other PDZ domain proteins that bind the DAT C-terminus. A screen of ~40 different PDZ domain including several prototypical synaptic PDZ domain proteins did not identify new DAT-binding partners 36 ; hence, further efforts are required to identify potential DAT-binding PDZ domains among an estimated total of 270 PDZ domains in 154 proteins (UniProtKB database). We find it unlikely that the phenotypes of our knock-in mice are the result of disrupting other types of protein–protein interactions because two very different but still PDZ-specific mutations (DAT-AAA/DAT+Ala) result in similar phenotypes. Also note that the binding of Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase IIα to the C-terminus of DAT is unaffected by mutation of the PDZ-binding sequence 37 .

Our data show that the level of active DAT in DAT-AAA mice is reduced dramatically in the striatum. According to our behavioural analysis, this reduction is accompanied by a hyperactive phenotype when the mice are exposed to a new environment, consistent with increased response to novelty. However, the hyperactivity appears transient as the mice display habituation and show activity indistinguishable from WT after 2 h. This is in contrast to DAT KO mice that show only modest habituation even after several hours 5 . In further contrast, DAT-AAA mice show less pronounced adaptive changes, as TH expression is essentially unaltered in DAT-AAA, whereas TH levels are reduced by 90% in DAT KO 38 . In addition, DAT-AAA mice show no growth retardation phenotype (Supplementary Table S1). Together, our data imply that the function of the residual transporters in DAT-AAA is sufficient for maintaining a 'closer to normal' homoeostasis within the dopaminergic system. It is also interesting to compare the DAT-AAA mice with DAT-knock-down (DAT KD) mice expressing ~10% of WT DAT levels 39 . DAT KD mice are hyperactive upon exposure to a novel environment and characterized by an equivalent modest habituation deficit similar to DAT-AAA and show no sign of endocrine deficits 39 . However, DAT KD and DAT-AAA mice show a difference in their response to amphetamine. Whereas amphetamine fails to induce hyperlocomotion in DAT-AAA mice, it inhibits locomotor activity in DAT KD mice similar to what is seen in DAT KO mice 39 . We have no immediate explanation for the differential effect of amphetamine. However, whereas the reduced DAT levels in DAT KD mice are caused by defective transcription 39, the DAT-AAA phenotype is related to changed turnover of translated protein, which may have differential functional consequences.

Summarized, we have generated two new mouse DAT models that together strongly support an indispensable role of a C-terminal PDZ-binding sequence in vivo . Furthermore, these two new mouse models are characterized by unique dopaminergic phenotypes and represent thereby novels tools for further dissecting the relationship between dopaminergic dysfunction and CNS disorders.

Metode

Spletna usmerjena mutageneza

Constructs were generated as described in Supplementary Methods.

Fluorescence polarization assay

Experiments were performed as previously described 14 .

Mouse genetics

Mutant alleles with modified C-termini were generated in CJ7 ES cells using the knock-in approach 40 as described (Supplementary Methods, Supplementary Figs S1 and S5). The PICK1-deficient mice were kindly provided by Dr Richard Huganir (Johns Hopkins University, Baltimore, USA). All mice experiments were performed in accordance with guidelines of the Danish Animal Experimentation Inspectorate (permission number: 2012/561-142).

Kvantitativni PCR v realnem času

Assay was carried out as described in Supplementary Methods.

Imunohistokemija

Adult mice were transcardially perfused with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS pH 7.4. Coronal and sagittal sections (40 μm) were generated from striatum and midbrain. For bright-field immunohistochemistry, a standard peroxidase-based method using 3, 3'-diaminobenzidine was used as previously described 41 . The following primary antibodies were used: rat anti-DAT antibody (MAB369 1:1, 000, Millipore, USA) or rabbit polyclonal anti-TH antibody (1:1, 000, Affinity Bioreagents, USA).

Co-localization studies of DAT-ir neurons were performed using dual-labelling immunofluorescence. Sections were incubated overnight with rat anti-DAT antibody (1:1, 000) and either rabbit anti-TH antibody (1:1, 000) or rabbit polyclonal LAMP1 (1:200, Abcam). The following day sections were rinsed and incubated with Alexa Fluor 488 goat anti-rat IgG (for DAT) and Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (for TH and LAMP1) conjugated secondary antibodies for 1 h (Molecular Probes, USA). Additional rinsing was followed by mounting of coverslips using Prolong Gold antifade reagent (Molecular Probes, USA).

Konfokalna mikroskopija

Confocal microscopy was performed as described 18, 23, using a Zeiss (Carl Zeiss, Germany) LSM 510 confocal laser-scanning microscope with an oil immersion 63 × 1.4 numerical aperture objective (Carl Zeiss). Alexa Fluor 488 dye was excited with a 488-nm laserline from an argon-krypton laser, and detection of the emitted light was done using a 505- to 530-nm bandpass filter. Alexa Fluor 568 dye and JHC 1–64 were excited with a 543-nm helium-neon laser and fluorescence was recorded using a 560-nm long-pass filter. Images were analysed with ImageJ software.

Quantification of optical density

Optical densitometry was applied for semi-quantification of DAT and TH immunoreactivity and performed as described in Supplementary Methods.

Glial coating

Astrocytes cultures from mouse cortex were made and maintained as previously described 42 . 5-fluorodeoxyuridine was added, when density reached 70%, approximately after 5 days.

Primary cultures of midbrain dopaminergic neurons

Postnatal dopaminergic neurons from WT and DAT-AAA mice were obtained and cultured as described 18 . Neurons were plated on glial-coated coverslips (~200, 000 cells per slide) for immunocytochemistry and in glial-coated 2-well LabTek chambers for live imaging (~100, 000 cells per well). Experiments were performed after culturing 7–14 days in vitro .

Imunocitokemija

Dopaminergic neurons, grown on glia-coated coverslips, were treated as described 43, though permebilization was done in PBS containing 5% goat serum and 0.2% saponin for 20 min. Primary rat anti-DAT antibody (MAB369 1:1, 000) and secondary Alexa Fluor 488 (goat anti-rat IgG) (1:500) were used to visualize DAT.

Lentivirus production and transduction

Lentiviral vectors encoding GFP-tagged WT and dominant-negative (K44A) dynamin (pFUGW-IRES-GFP Dynamin K44A or pFUGW-IRES-GFP Dynamin) were kindly provided by Dr Rosalind A Segal (Harvard Medical School, Boston, MA), and produced as described 18 . Dopaminergic neurons were transduced at day 1–3 in vitro and experiments were performed 7–10 days after infection.

Live imaging of dopaminergic neurons

Surface-expressed DAT was visualized in live ventral midbrain dopaminergic neurons, transduced as well as untransduced, as described 18, using 10 nM JHC1–64 for 20 min at room temperature to stain DAT.

The effect of inhibiting dynamin-dependent endocytosis on DAT surface levels was evaluated by quantifying mean JHC 1–64 labelling intensity of WT and DAT-AAA neurons, transduced with pFUGW-IRES-GFP Dynamin K44A or pFUGW-IRES-GFP WT Dynamin as control. Transduced neurons were identified from the coupled EGFP expression. Excitation and recording of JHC 1–64 fluorescence (see 'confocal microscopy') was carried out using identical settings for all pictures taken of a given genotype, but differences in expression made it necessary to use different settings for WT and DAT-AAA neurons. A region of interest (ROI), containing the neuronal soma and proximal extensions, was manually selected on single confocal sections. The mean intensity of JHC 1–64 labelling within this ROI was quantified as the mean pixel intensity divided by the area percentage with JHC 1–64 signal, using the same threshold for all images of a given genotype.

Internalization of DAT in live WT and DAT-AAA neurons was assessed as described 18, using 10 nM JHC 1–64 to label surface DAT at 4 °C before 1 h internalization at 37 °C (or 4 °C as a temperature control). The neuronal soma and proximal extensions was manually selected on single confocal sections (ROI-total). The cytoplasmic region of ROI-total (that is, excluding the plasma membrane) was subsequently manually defined (ROI-internalized). Threshold was set as twice the mean intensity within ROI-total, to ensure that only specific JHC 1–64 signal contributed to the quantification. The total integrated JHC 1–64 intensity within ROI-total was taken as a measure of the entire labelled DAT pool, while the total integrated JHC 1–64 intensity within ROI-internalized was taken as a measure of internalized DAT/JHC 1–64. The internalized fraction of DAT/JHC 1–64 complexes was obtained as the ratio between the internalized JHC 1–64 and the total JHC 1–64. Of notice, differences in expression made it necessary to use images taken with different settings for quantification of WT and DAT-AAA internalization.

For LysoTracker co-localization studies, internalized DAT was visualized as described above, adding LysoTracker green (100 nM; Molecular Probes) in the last 15 min of incubation to visualize lysosomes. Neurons were washed twice in uptake buffer before imaging.

Membrane and whole-cell lysate preparations

Preparation of membrane fractions from adult mice striata and whole pup brains is described in Supplementary Methods, along with the preparation of whole-cell lysates from adult mice striata (for estimations of total TH expression) and whole-cell lysates from cultured dopaminergic neurons.

Brain slice preparation and surface biotinylation

Experiments were performed as described in Supplementary Methods, modified from ref. 44.

Imunobloting

Immunoblotting was performed as described in Supplementary Methods.

Dopamine uptake in vitro

Uptake experiments were performed as described in Supplementary Methods.

Striatal membrane binding assay

Competition binding assays were performed on striatal membrane preparations, using the DAT ligand, [125I]-RTI-55 (2, 200 Ci per mmol, Perkin Elmer, USA). Membrane suspensions were mixed with ~1 nM [ 125 I]-RTI-55 in a total volume of 500 μl and samples were incubated in binding buffer containing 25 mM HEPES pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO 4 for 2 h at 4 °C with constant shaking. To avoid unspecific binding of RTI-55 to the serotonin and norepinephrine transporters, 50 nM s-citalopram and 100 nM desipramine were included. The assay was terminated with ice-cold binding buffer, followed by loading of membranes on glass microfiber filters (GF/C Whatman). Filters were rinsed in ice-cold binding buffer and allowed to dry before scintillation fluid was added and samples were counted 1 h thereafter. Non-specific binding was assessed in the presence of 1 mM dopamine. Binding data were analysed by non-linear regression analysis assuming one-site binding (GraphPad Prism 5.0).

Autoradiography

Assay was performed as described in Supplementary Methods.

Synaptosomal dopamine uptake

Striata were dissected out from coronal slices and homogenized in ice-cold HEPES buffer (4 mM, pH=7.4) containing 0.32 M sucrose. Crude synaptosome fraction (P2) was obtained as described in membrane preparations (Supplementary Methods) and dopamine uptake was performed with minor modifications 45 . Unlabelled dopamine (0.125 μM) was added together with [3H]-Dopamine (Perkin Elmer Life Sciences, USA) for assessment of dopamine uptake for 5 min at 37 °C. Uptake was terminated by addition of ice-cold uptake buffer. Non-specific uptake was determined in the presence of 100 μM cocaine. Synaptosomes were loaded on glass microfiber filters (GF/C Whatman), rinsed 4 × 5 ml in uptake buffer and allowed to air-dry. Scintillation fluid was added and filters were agitated for 1 h followed by counting.

Behavioural phenotype assessment (SHIRPA)

Behavioural and physical characteristics of experimentally naive mice were assessed using the SHIRPA primary screen procedure as described 17 .

Basal locomotion and amphetamine-induced hyperactivity

Using a previously described set-up 46, three experiments were carried out. (1) Basal locomotor activity: the animal was placed in an activity box and the activity measured for 4 h; (2) 1 h amphetamine-induced hyperactivity after ip injection of amphetamine (1–3 mg kg −1 ) or saline; (3) amphetamine-induced hyperactivity (2 mg kg −1 ip) for 2.5 h after habituation to the activity boxes for 2.5 h. Furthermore, basal locomotion of DAT-AAA, DAT+Ala KI and PICK1 KO mice and WT littermates was investigated in an open-field test. The animals were placed individually in the centre of an open field (40 × 40 × 65 cm), illuminated indirectly by four 60-W white light bulbs, and allowed to explore the apparatus for 30 min (ref. 46). Behaviour was recorded with a camera mounted on the ceiling directly above the open field and total distance moved was analysed using EthoVision Software (version 3.0; Noldus, The Netherlands).

Statistika

Unless otherwise stated Mann–Whitney non-parametric test was applied. One- or two-way analysis of variance, followed by Bonferroni post-hoc t -tests or Kruskal–Wallis non-parametric test, were applied when comparing more than two groups. Raven pomembnosti je bila določena pri P <0, 05.

Dodatne informacije

How to cite this article: Rickhag, M. et al . A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat. Komun. 4:1580 doi: 10.1038/ncomms2568 (2013).

Spremeni zgodovino

Dodatne informacije

Datoteke PDF

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Supplementary Figures S1-S5, Supplementary Table S1, Supplementary Methods and Supplementary References

Pripombe

Z oddajo komentarja se strinjate, da se boste držali naših pogojev in smernic skupnosti. Če se vam zdi nekaj zlorabe ali ne ustreza našim pogojem ali smernicam, označite to kot neprimerno.