Povezava polimorfizmov gena za receptorje melanokortina 1 (mc1r) z odbojnostjo kože in pege v japonščini | časopis za človeško genetiko

Povezava polimorfizmov gena za receptorje melanokortina 1 (mc1r) z odbojnostjo kože in pege v japonščini | časopis za človeško genetiko

Anonim

Predmeti

  • Študija genetske povezanosti
  • Genska variacija

Izvleček

Večina raziskav na genetski osnovi pigmentacije kože se je osredotočila na ljudi evropskega porekla, le nekaj študij pa se je osredotočilo na azijsko populacijo. Raziskali smo povezavo odbojnosti kože in pege z genetskimi različicami gena za receptorje melanokortina 1 ( MC1R ) v japonščini. Vzorci DNK so bili odkupljeni od skupno 653 japonskih posameznikov (starih 19–40 let) s prebivališčem v Okinavi; odbojnost kože smo merili s spektrofotometrom in za vsakega posameznika smo določili stanje pege. Indeks lahkotnosti ( L * ) in pesek niso bili povezani s starostjo, indeksom telesne mase ali prednikom (Ryukyuan ali Japonski glavni otoki). Med 10 nesinonimnimi različicami, ki smo jih identificirali z neposrednim zaporedjem kodirnega območja MC1R , sta bili najpogostejši dve različici - R163Q in V92M - z izbranimi frekvencami alelov 78, 6 oziroma 5, 5%. Večkratna regresijska analiza je pokazala, da sta alel 163Q in prisotnost nesinonimnih redkih variant (alelne frekvence <5%) pomembno povezana s povečanjem spolno standardizirane lahkotnosti kože ( L * CIELAB (CIE 1976 (L * a * b *)) barvni prostor)) notranje nadlaktice. Glede na alel 92V je bil alel 92M bistveno povezan s povečanimi verjetnostmi pege. To je prva študija, ki je pokazala povezavo med vrednostmi alel 163Q in odbojnostjo kože; to združenje je nakazovalo, da je pri vzhodnoazijskih ljudeh morda bila izpostavljena pozitivna selekcija svetlobe na koži.

Uvod

Človeško telo je ovito s kožo, ki služi kot vmesnik za interakcijo med telesom in njegovim okoljem. Koža tvori oviro pred vdorom mikrobov in ščiti telo pred poškodbami, ki jih povzročajo kemikalije, toplota in ultra vijolično (UV) sevanje. Pomembna vloga človeške kože je nadziranje telesne temperature s potenjem in poznejšimi izgubami toplote. 1 Druga vloga kože je posredovanje sinteze vitamina D, kadar je izpostavljenost soncu. 2 Kot vmesnik med telesom in okoljem lahko vse te funkcije kože štejemo kot prilagoditve različnim vrstam okolij, ki obdajajo naše prednike, pri čemer oblikujejo geografske razlike v značilnostih kože, vključno s pigmentacijo pri sodobnem človeku. 3, 4 Navidezna geografska variacija pigmentacije kože je pritegnila tako javno kot akademsko pozornost in je bila preučena na številnih raziskovalnih področjih, kot so evolucijska biologija, klinična medicina, zdravstvena znanost, fiziologija in molekularna genetika, 5, 6, 7, 8 kot pa tudi sociologija in psihologija. 9, 10, 11

Za razlago razvoja pigmentacije kože so bile predlagane različne hipoteze; te hipoteze povzemamo na naslednji način. Temni koži se zdi, da je naklonjena naravni selekciji v bližini ekvatorja, kjer je UV-sevanje veliko, ker temna koža ščiti telo pred pregrevanjem in sončnimi opeklinami12, pa tudi pred poškodbami DNK in folne kisline, ki jih povzroča UV. 3 Na velikih zemljepisnih širinah, vključno z Evropo, se lahko izbere lahka koža, ki omogoča sintezo zadostnega vitamina D tudi v pogojih nizkega UV sevanja; nasprotno, temna koža lahko povzroči povečano dovzetnost za rahit na velikih zemljepisnih širinah. 2, 13 Jablonski in Chaplin 4 sta poročala o povezavi med količino kožnega melanina in ravni UV sevanja med avtohtonim prebivalstvom; to korelacijo so pojasnili z ravnovesjem med fiziološkimi zahtevami za sintezo vitamina D in zaščito folatov pred UV. Druga razlaga depigmentacije kože je nevtralna evolucija; Zmanjšanje izpostavljenosti UV-sevanju za populacije, ki so se selile stran od ekvatorja, je odpravilo omejitve, ki ohranjajo temno kožo. 14 Vendar nedavne ugotovitve molekularne in teoretične genetike kažejo, da samo naključno gensko odnašanje ne zadostuje za hitrost evolucije lahke kože. Darwin 15 je dolgo pred temi predlogi domneval, da je raznolikost barve človeške kože nastala s spolnim izborom s postopkom izbire mate, zlasti na območjih z velike širine. Zato je treba pri raziskovanju razvoja pigmentacije kože pri ljudeh upoštevati spolno selekcijo in tudi naravno izbiro. 16, 17

Odsev človeške kože je kvantitativna genetska lastnost s kontinuumom od temne do svetlobe. Tradicionalno so študije merjenja barv na ljudeh uporabljale nabor barvnih plošč ali barvnih kategorij, kot sta von Luschanjeva kromatska lestvica in barvna plošča Broca. 12, 18, 19 Pozneje je bila uvedena lestvica Fitzpatrick, ki je razvrstila odziv kože na sonce v šest kategorij. 20 Kot je tehnologija napredovala, so barvne plošče zamenjali spektrofotometri. 21, 22 Ocenjevanje na podlagi vprašalnika, na primer kategorije samoporočanja (pošteno / bledo, srednje ali oljčno / temno) in Fitzpatrickova lestvica, se še vedno uporabljajo celo v študijah, povezanih z genomi, osredotočenimi na ljudi evropskega porekla. 23 Vendar metode, ki so odvisne od poljubnih kategorij barve kože ali Fitzpatrick-ove lestvice, morda niso veljavne za vzhodne Azijke; na primer vsi udeleženci študije Motokawa in sod. 24 jih je bilo razvrščenih v kategorijo „srednje“ in vrste kože II – IV. Zato so spektrofotometri, ki omogočajo objektivne in dosledne barvne meritve, bolj primerni za merjenje odbojnosti kože vzhodnih Azijcev.

Gen receptorja za melanokortin 1 ( MC1R , MIM 15555) je zelo pomemben pri pigmentaciji človeške kože. MC1R se nahaja na človeškem kromosomu 16q24.3 in kodira en ekson s 954 bp in beljakovine 317 aminokislin. 25 Protein MC1R je sedem transmembranskih receptorjev, vezanih na G, za beljakovine, za simulacijo hormona α-melanocitov. Ko se simulacijski α-melanocitni hormon veže na aminokislinsko zaporedje His-Phe-Arg-Trp (TFRW) MC1R, ki se nahaja na zunajcelični površini melanocita, kasnejša aktivacija adenilat ciklaze olajša kopičenje cikličnega adenosinovega monofosfata v melanocit; to kopičenje na koncu spodbuja sintezo eumelanina (temnega pigmenta). 26, 27 Zato ima aktivacija MC1R ključno vlogo pri pigmentaciji kože, saj ima za posledico prehod iz sinteze feomelanina (lahkega in nezrelega pigmenta) na sintezo eumelanina. 28

Molekularni dokazi kažejo, da (1) aleli MC1R so bili v Afriki čistilni ali negativni selekciji, kjer je UV sevanje vse leto visoko; (2) sprostitev stiske je spodbudila nevtralen razvoj MC1R v velikih zemljepisnih regijah, kot je Evropa; 29 in (3) so nekateri aleli morda bili predmet usmerjene izbire. 30 Zato je kodirano območje MC1R pri Afričanih zelo ohranjeno, medtem ko so pri populacijah evropskega porekla poročali o več kot 30 nesinonimnih in sinonimnih različicah. 31 Pri azijskih populacijah so poročali o več kot 10 različicah, od katerih sta različici V92M in R163Q na visokih frekvencah v primerjavi s frekvencami, ki jih opažamo pri neazijskih populacijah. 32, 33, 34 Nedavna preiskava genomov za selektivne preiskave je pokazala, da je močna pozitivna selekcija vplivala na gene, povezane s pigmentacijo. 35, 36, 37 Coop in sod. 38 je predlagalo podpis „vzhodnoazijske preiskave“ na R163Q (rs885479), ki temelji na F ST in XP-EHH, v podatkih o enukleotidnem polimorfizmu (SNP) na celotnem genomu iz podatkov HapMap, panela za raznolikost človeškega genoma CEPH in podatkov Perlegen nabor.

Funkcije obeh variant, V92M in R163Q, so bile preučene predvsem glede pege in lentiginov pri Azijskih ter rdečih las, bledo kožo in pegetastih fenotipov pri Evropejcih. Študija japonske populacije je poročala, da sta alela 92M in 163R povezana s sončnimi lentigini in pege. 39 Pri ljudeh evropskega porekla naj bi bili trije aleli - V60L, V92M in R163Q - različice rdeče barve las z nizko penetracijo označene z „ r “, štirje aleli pa - D84E, R151C, R160W in D294H - z oznako „ R “ so visoko propustni varianti rdeče barve las. 40 Učinek alelov R je pomenil pomembno povezavo med SNP-ji na območju okoli MC1R in barvo las ali porjavitev kože. 23, 41 V študiji Duffy in sod. , 42 r alelov je bilo povezano z 0, 9% povečanjem odbojnosti kože na notranji nadlahti, vendar je bil porast manjši od tistega, povezanega z aleli R (1, 9%). Pri Azijcih so povezave V92M in R163Q z odbojnostjo kože redko preučevali. Izjema je študija o tibetanski populaciji; glavni učinki teh dveh variant niso bili pomembni, vendar je bila interakcija med V92M in SNP v OCA2 povezana s povečanjem lahkotnosti ( L * ) kože na notranji nadlakti. 43

Povezava različic MC1R z odbojnostjo kože še vedno ni jasna pri večini prebivalstva vzhodne Azije, vključno s celotnim prebivalstvom Japonske; vendar nekateri raziskovalci menijo, da je pozitivna selekcija delovala na alelih MC1R pri prebivalcih vzhodne Azije. 38 Zato smo raziskali vpliv variant MC1R na pigmentacijo kože pri velikem vzorcu Japonskih ljudi, tako da smo analizirali povezavo med različicami MC1R in odbojnostjo kože, objektivno količinsko ovrednoteno s spektrofotometrom, pa tudi pege.

Materiali in metode

Predmeti

Preiskovanci so sestavljali 653 zdravih prostovoljcev (364 moških in 289 žensk). Starost preiskovancev se je gibala od 19 do 40 let (povprečje = 23, 62, sd = 4, 62). Informirano soglasje je bilo pridobljeno od vsakega posameznika. To študijo je odobrila komisija za raziskovalno etiko Univerze v Rjukiju. Udeleženci so prosili, naj prostovoljno razkrijejo svoj spol, starost in kraj rojstva svojih štirih starih staršev. V tej študiji se „otoki Ryukyu“ nanaša na najjužnejše otoke na Japonskem, ki vključujejo Okinava, Sakishima in Amami. Preostali del japonskega arhipelaga je bil opredeljen kot „glavni otoki Japonske“ (slika 1). Indeks Ryukyu je bil opredeljen kot število starih staršev z otokov Ryukyu, in sicer od 0 (nobeden od starih staršev ni bil z otokov Ryukyu) do 4 (vsi štirje stari starši so bili z otokov Ryukyu). Indeks telesne mase (ITM) vsakega preiskovanca je bil izračunan glede na telesno višino in težo, ki sta bila izmerjena z antropometrom in prenosno digitalno lestvico (povprečna = 21, 58, sd = 3, 10 za ženske; povprečna = 23, 20, sd = 3, 61 za moške) .

Image

Zemljevid otokov Japonske razdeljen v dve skupini, otoki Ryukyu in glavni japonski otoki. V tej študiji so otoke Ryukyu obsegali otoke Okinawa (vključno z otokom Okinawa, kjer so prebivali preiskovanci), Sakishima in Amami. Kljub upravljanju prefekture Okinawa so otoki Daito izključeni z otokov Ryukyu zaradi genetskega ozadja prebivalcev, ki so v veliki meri izhajali iz relativno nedavnih naseljencev z otoka Hachijo v Tokiu.

Slika v polni velikosti

Odsev kože

Odbojnost kože vsakega subjekta smo med junijem 2009 in marcem 2011 merili s spektrofotometrom (Konica Minolta CM-600d; Konica Minolta Optics, Inc., Tokio, Japonska). Ta naprava meri odbojnost predmeta s komponento, ki sprejema svetlobo in pretvori podatke v različne barvne sisteme, kot so CIELAB in spektralna krivulja. Meritev smo izvedli na notranji nadlakti vsake osebe v mirovanju. Vsak udeleženec je podaljšal levo roko tako, da je bila notranja stran obrnjena navzgor, da bi se izognili napaki zaradi položaja roke, 44 in izmerili srednjo točko med pazduho in komolcem.

Vrednotenje pege

Pege so majhne (1–3 mm) svetlo rjave makule na obrazu, rokah in hrbtu; pege postanejo izrazite zaradi izpostavljenosti soncu in zbledijo pozimi. 45, 46 Pri Japonskih so pege temno rjave barve in so lahko velike do 5 mm v premeru. 47 Ocenili smo pege na posnetku glave vsakega udeleženca in ocenili, da so pege 'prisotne' pri posameznikih z več makuli na nosnem hrbtenici in zgornjem obrazu ter da so 'posamezniki brez makule na nosnem hrbtu' odsotni.

Genotipizacija in haplotipizacija

Genomski DNK je bil odvzet iz vzorca krvi ali sline vsakega udeleženca z uporabo Gentra Puregene Blood Core Kit ali QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Nemčija) po protokolih izdelave. Genotipizacija je bila izvedena po metodi neposrednega zaporedja. Zasnova (našteta v dodatni tabeli S1) smo zasnovali s pomočjo brezplačnega spletnega programa Primer3 in sklicevanja na GenBank zaporedje NG_012026. Gnezdeni PCR smo izvedli za pomnoževanje odprtega bralnega okvira MC1R v 20-μl skupni prostornini, ki vsebuje 0, 8 enote FastStart Taq PCR Master (Roche Diagnosis, Basel, Švica), 1 × PCR pufer + MgCl 2 in 200 μM od vsak deoksiribonukleotid trifosfat. Parametri kolesarjenja so bili naslednji: začetna denatura 95 ° C × 1 min, 40 ciklov 95 ° C × 30 s, 60 ° C × 30 s in 72 ° C × 90 s, končna razširitev 72 ° C × 7 min in 20 ° C za shranjevanje. Za gnezdeni PCR nekaterih vzorcev smo uporabili drugačen encim; te reakcije smo izvedli v 20 μl skupni prostornini, ki je vsebovala 0, 5 enote TaKaRa ExTaq DNA polimeraze (Takara Biotechnology, Shiga, Japonska), 1 × PCR pufer in 200 μM vsakega deoksiribonukleotid trifosfata. V tem primeru so bili kolesarski parametri naslednji: začetna denatura 94 ° C × 1 min, 40 ciklov 98 ° C × 10 s, 55 ° C 30 s in 72 ° C × 60 s, končna razširitev 72 ° C × 1 min in 4 ° C za shranjevanje. Izdelke PCR smo zaporedoma uporabili s kompletom za zaporedje ciklov BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) bodisi z ABI PRISM 310 bodisi 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies); zaporedja smo nato analizirali s CodonCode Aligner (CodonCode Corporation, Dedham, MA, ZDA). MC1R haplotipi so bili ocenjeni s PHASE različico 2.1, 48, 49, nato je bila mreža haplotipov sestavljena po metodi srednjega spajanja s programsko opremo NETWORK (fluxus-engineering.com). 50

Selektivno nevtralnost območja kodiranja MC1R smo preizkusili s Tajima-jevim D- jem s programsko opremo Arlequin ver. 3.5.1.3. 51, 52 Pomen Tajima-jevega D je bil preizkušen s P- vrednostjo, dobljeno kot delež simuliranega D, ki je manjši ali enak opazovanju v 1000 simulacijah z uporabo algoritma koalescentne simulacije (enostranski test).

Statistične analize

Statistične analize so bile izvedene z uporabo IBM SPSS Statistics različice 19 (SPSS, Inc., IBM podjetje, Chicago, IL, ZDA). Razen če ni drugače navedeno, smo sprejeli stopnjo pomembnosti 0, 05. Pri večkratnem testiranju je bila stopnja lažnega odkrivanja nadzorovana na ravni 0, 05 po metodi, ki sta jo predlagali Benjamini in Hochberg, 53, 54, za katero je bilo ugotovljeno, da je učinkovita za kvantitativno analizo lokusov lastnosti.

V spolno stratificirani analizi so povezave med vrednostmi L * in genotipi preizkusili ločeno za samice in moške. Potem so rezultate za ženske in moške združili z meta-analizami z dvema metodama: Fisherjevo r -to- z metodo transformacije, ki združuje standardizirane regresijske koeficiente, specifične za spol, in obratno normalno metodo, ki združi več P- vrednosti, neodvisno od učinka velikosti. 55

Poleg tega so vrednosti L * prilagodili glede na spol tako, da so jih standardizirali v z -scores ločeno za moške in ženske. Izvedene so bile številne regresijske analize, da smo pregledali povezave med variantami MC1R in z -scores vrednosti L * na notranjih nadlahtih (ZL *), pri teh analizah pa smo nadzirali kovariate.

Pri variantah z alelnimi frekvencami, manjšimi od 0, 05, smo genotipe kodirali kot število izpeljanih alelov (AA = 0, AD = 1, DD = 2; A = alel prednikov, D = izpeljani alel) ob predpostavki, da je aditiv (koominanten ) model, pri čemer ima DD namesto AA dvakrat večjo verjetnost, da bo vplival na L *, kot da ima AD namesto AA. Nesinonimne variante s frekvencami pod 0, 05 so bile združene kot „redke variante“, spremenljivka, označena RARE, pa je bila opredeljena kot število redkih različic, ki jih je prejel posameznik, saj je bila velikost vzorca vsake redke variante premajhna, da bi jo lahko posebej preizkusili . Nadalje smo preučili prevladujoči model, pri katerem ima genotip AD ali DD in ne AA enako verjetno, da vpliva na L * (genotipno kodiranje: AA = 0, AD = 1, DD = 1), in recesivni model, pri katerem samo DD vpliva na L * (AA = 0, AD = 0, DD = 1).

Kovariati so vključevali starost (AGE), prednike (Ryukyu indeks) in indeks telesne mase, pa tudi mesec, ko je bila opravljena vsaka meritev. Dvanajst dvanajst samic in 219 moških je bilo iz indeksa Ryukyu = 4, 43 žensk in 95 moških pa iz indeksa Ryukyu = 0. Druge kategorije za indeks Ryukyu so imele majhne vzorčne velikosti (2, 47, 19 za indeks Ryukyu = 1, 2 oziroma 3; 16 udeležencev je imelo vsaj enega starša z neznanim rojstnim krajem). Za mesec je bila postavljena lutkovna spremenljivka JAN enaka 1, če je bila meritev opravljena januarja ( n = 19) in enaka 0, sicer. Podobno je bilo opredeljenih 5 dodatnih lutkovnih spremenljivk JUN, JUL, AUG, OCT in NOV ( n = 60, 110, 58, 28 in 108) na enak način kot spremenljivka JAN, ki so bile decembra postavljene kot izhodiščne vrednosti, ker velikost vzorca je bila največja ( n = 269). Februarja, aprila, maja in septembra ni bilo izvedenih nobenih meritev. Marca smo izmerili le enega posameznika, zato smo vzorec vključili v JAN.

Razmerje med temi spremenljivkami in ZL * smo preučili s Spearmanovo korelacijsko lestvico, t -test, Mann-Whitney U -test, Kruskal-Wallisov test in multiplo regresijo. Pri večkratni regresijski analizi smo podatke prilagodili modelu

Image

kjer je X 1, X 2,

.

, X k so neodvisne spremenljivke. Multikolinearnost je bila ocenjena s faktorjem inflacije variance. Najboljši model je bil določen s postopnim regresijskim postopkom z verjetnostjo, da bo F vnesel 0, 05 in verjetnostjo, da bo F odstranil 0, 10. Preizkusili smo tudi vpletenost interakcije, ki je v modelu opisana kot produktni izraz dveh neodvisnih spremenljivk, kot je X 1 X 2 . Analize, ki so vključevale vrednosti zaznavkov L *, so v osnovi dale enake rezultate kot analize, ki so izključile te odstranjevalce; zato smo vključili odstranjevalce, da smo zaznali učinek variant na skrajnih koncih podatkov.

Pred analizo povezave MC1R s pegetanjem je bil izračunan Spearmanov koeficient korelacije (ρ) med pege in kovarijati dveh neprekinjenih spremenljivk, starosti in ITM. Za kategorične spremenljivke, vključno s spolom, Ryukyu indeksom in mesecem, je bil izveden Pearsonov χ 2- test za kategorične spremenljivke. Izračunano je bilo razmerje kvot (OR) za pege manjšega alela pri vsakem SNP glede na alel konsenzusa vzorca. 95% interval zaupanja (CI) za vsak OR je bil pridobljen z OR ± 1, 96 se, da se preveri, ali se OR bistveno razlikuje od vrednosti 1. ALI vrednosti, ki niso bistveno drugačne od 1, kažejo, da ni bilo povezave med alelom in pege . Za logistično regresijo smo podatke prilagodili modelu

Image

kjer je X 1, X 2,

.

, X k so neodvisne spremenljivke. Za izbiro najboljšega modela smo uporabili enaka stopničasta merila, uporabljena za zgoraj opisano linearno večkratno regresijsko analizo. Predpostavljeni je bil model aditivov (soodvladujočega) in genotipi so bili obravnavani kot kontinuirane spremenljivke. OR za X k smo dobili z eksponentno funkcijo, exp ( β k ).

Izvedli smo tudi asociacijske analize alelov 92M in 163Q z odbojnostjo kože in pege, po postopku, uporabljenem v Duffy et al. 42 Definirali smo spremenljivko, označeno s r , kot skupno število alelov 92M in 163Q. Odstotni odboj na valovni dolžini 650 nm je bil namesto ZL * uporabljen kot odvisna spremenljivka.

Rezultati

Povprečne vrednosti L * so bile za ženske in moške 67, 07 oziroma 64, 58. Enakost odstopanj je bila zavrnjena (sd = 2, 47 za žensko, 3, 30 za moške; F = 15, 27, P = 1, 03E – 04), t- test za enakost sredstev pa je pokazal pomembno razliko med spoloma v srednjih vrednostih L * ( enaka odstopanje ni predpostavljeno, P = 4, 71E-26). Zato so bile vrednosti L * standardizirane za vsak spol in združene za naslednje analize.

Nato smo pred večkratno regresijo preučili vpliv kovariatov na ZL *. Starost in BMI nista bila v korelaciji z ZL * (starost: Spearmanov ρ = 0, 09, P = 0, 818; BMI: ρ = 0, 038, P = 0, 334), zato sta bili izključeni iz regresije. Primerjali smo Ryukyuans (indeks Ryukyu = 4) in japonski Main Main (indeks Ryukyu = 0) in nismo ugotovili pomembne razlike v ZL * med obema skupinama ( t- test, enake odstopanja, predpostavljene, P = 0, 855). Zato je bil tudi indeks Ryukyu izključen iz modela večkratne regresije. Ko je bil ZL * regresiran na matrične spremenljivke, ki se nanašajo na mesec, sta bili dve takšni spremenljivki, JUN in JUL, vključeni v najboljši model, kot je opredeljen z uporabo stopenjske metode; zato sta bili ti dve spremenljivki lutke združeni kot JUN_JUL, da bi ju vključili v kasnejšo regresijsko analizo kot kovariat.

Kot rezultat sekvenciranja kodirnega območja MC1R smo našli 20 variant, od katerih so bile 10 nesinonimne mutacije; ostalo so bile sinonimne mutacije. Pri izvedenih frekvencah alelov, višjih od 5% (5, 5% za V92M, 78, 6% za R163Q in 8, 2% za 942A> G) smo opazili eno sinonimno in dve nesinonimni različici. Od ravnotežja Hardy-Weinberg ni bilo pomembnega odstopanja. Preostale nesinonimne variante smo opazili le v heterozigotskem stanju in jih sešteli v dvomljivo spremenljivko RARE, ki je prevzela katero koli od dveh vrednosti 0 ali 1 (tabela 1). V študijah, ki so bile usmerjene na ljudi evropskega potomstva, nismo našli različic, ki bi bile močno povezane s pigmentnimi lastnostmi. 42, 56, 57 Slika 2 prikazuje mrežo haplotipov na podlagi ocenjenih haplotipov vzorca. Kot je razvidno iz največjega kroga s številnimi vejami, je imela večina ocenjenih haplotipov alel 163Q. Za test selektivne nevtralnosti je bil Tajimajev D izračunan kot -1, 66 s P- vrednostjo 0, 015, kar je nakazovalo odstopanje od nevtralnosti in možnost čiščenja ali pozitivne selekcije na MC1R .

Tabela polne velikosti

Image

MC1R mreža haplotipov, ki temelji na ocenjenih haplotipih 1306 kromosomov, ovrednotenih v tej študiji. Vsak krog predstavlja haplotip z njegovimi spremembami aminokislin, ki jih označuje krog ali v njem. Velikost vsakega kroga odraža frekvenco haplotipa. Najmanjši krog je enak 1 od 1306 kromosomov, največji krog pa 931 kromosomov. Osnovne spremembe so označene po črtah, ki povezujejo kroge, ki so široke za ne-anonimne. Trije haplotipi, ocenjeni z verjetnostjo 0, 5 z R163Q, so označeni s črtkanimi črtami.

Slika v polni velikosti

Postopno večkratna regresijska analiza z genetskimi dejavniki je določila najboljši model

Image

kjer je bil učinek alela 163Q in redkih različic pomemben ( P = 0, 016 oziroma P = 0, 018 v tem primeru; Slika 3), vendar V92M in 942A> G nista bila pomembna ( P = 0, 093 oziroma 0, 067). Izraz interakcije med R163 in RARE (R163Q × RARE) je bil v modelu nepomemben ( P = 0, 67). R163Q in RARE sta ostala pomembna tudi po nadzorovanju napačne stopnje odkritja po metodi Benjaminija in Hochberga, pri čemer je bila druga najnižja vrednost P- vrednosti manjša od 0, 025 (= 0, 05 × 2/4), čeprav po Bonferronijevi korekciji niso bili pomembni (stopnja pomembnosti = 0, 05 / 4 = 0, 0125). Prilagojeni R2 je bil 0, 012; zato je model razložil le 1, 2% celotne spremenljivosti v L * notranje zgornje roke za vrednosti L *, ki so bile standardizirane glede na spol. 55

Image

Boxplot L * (lahkotnost), kategoriziran po genotipu R163Q in združen z redkimi haplotipi. Z -skorak L * na notranji nadlakti je bil razvrščen po genotipih R163Q in v skupini MC1R združen s haplotipi redkih variant . Haplotip „163R + redek“ pomeni, da je redka različica nameščena na istem haplotipu kot alel 163R; „163Q + redko“ pomeni, da haplotip vsebuje alel 163Q; in "0" pomeni, da je redka različica odsotna. Za haplotipe, ocenjene z verjetnostjo 0, 5, se je domnevalo, da so "163Q + redki". Dno polja je 25. pertiletil, srednja črta je srednja, zgornji del pa 75. pertiletil. Vrstice iz polja predstavljajo obseg podatkov, razen tistih s črnimi pikami, kjer se palice raztezajo do 1, 5-krat dlje od polja, podatki, ki se nahajajo na koncu vrstice, pa so odpuščeni, označeni kot odprte pike. Kruskal-Wallisov test je zavrnil ničelno hipotezo o enaki populacijski mediani za genotipe R163Q, kadar je redki haplotip = 0 ( P = 0, 012), kot tudi za redke haplotipe, ko je R163Q = RQ ( P = 0, 010). V paru so bili izvedeni parni testi za enake mediane z Mann-Whitney U -testom in P- vrednosti so prikazane na sliki.

Slika v polni velikosti

Spolno stratificirana analiza je pokazala, da sta bila regresijska koeficienta za R163Q in RARE pri ženskah 0, 127 ( P = 0, 036) in 0, 085 ( P = 0, 158), pri moških pa 0, 095 ( P = 0, 081) in 0, 101 ( P = 0, 064) (dodatna tabela S2). Čeprav so bili regresijski koeficienti pri spolno stratificirani analizi nepomembni, razen R163Q pri ženskah ( P = 0, 036), je metaanaliza pokazala, da so združeni standardizirani koeficienti pomembni za R163Q ( P = 0, 0059), tudi po Bonferronijevi korekciji in za RARE ( P = 0, 018), tudi po nadzoru stopnje napačnega odkritja po metodi Benjaminija in Hochberga (dodatna tabela S3). 53, 55 Združene P- vrednosti z uporabo obratne normalne metode so prav tako podprle pomen (R163Q: P = 0, 0033; RARE: P = 0, 011) tudi po Bonferronijevi korekciji, pa tudi po nadzoru napačne stopnje odkritja (dodatna tabela S3). 55

Ko smo dodali mesečne spremenljivke, je postopna večkratna regresijska analiza določila najboljši model

Image

Vključna spremenljivka za mesec (JUL_JUN), število alelov 163Q (R163Q) in prisotnost redkih različic (RARE) so še vedno imeli pomembne koeficiente ( P = 3, 14E – 10, 0, 016 in 0, 026; Tabela 2). Prilagojeni R2 je bil 0, 072, kar kaže, da je najboljši model pojasnil 7, 2% celotne spremenljivosti v ZL *. Interaktivni izrazi med vsako spremenljivko (JUN_JUL × R163Q, JUN_JUL × RARE in R163Q × RARE) niso bili pomembni, če so bili dodani najboljšemu modelu ( P = 0, 804, 0, 832 in 0, 418). Čeprav je bil V92M izključen iz najboljšega modela, je bil koeficient regresije 0, 05 ( P = 0, 196), ko ga dodamo v model.

Tabela polne velikosti

Zgornji model je bil razvit na podlagi predpostavke aditivnega (koominantnega) modela za varianto R163Q. Nato smo preučili dominantne in recesivne modele. Za prevladujoči model je postopna regresijska analiza določila najboljši model z le JUN_JUL kot pomembnimi opisnimi spremenljivkami. Za recesivni model je bil najboljši model, določen s postopno večkratno regresijsko analizo

Image

s prilagojenim R2 0, 073, kar kaže na ustreznost kot model dodatkov (tabela 2).

Na podlagi ocenjenih haplotipov smo redke variante razdelili v dve skupini, 163R + redka in 163Q + redka, odvisno od alela na R163Q, ki se nahaja na istem haplotipu kot nesinonimne redke variante. Le en haplotip, tisti z 120T, je bil vsebovan v redkih 163R +; nasprotno pa je bilo v 163Q + redkih sedem različnih haplotipov. Ko smo izvedli postopno večkratno regresijsko analizo s 163R + redko in 163Q + redko namesto RARE, niti eden ni ostal v najboljšem modelu ( P = 0, 141 za 163R + redko in P = 0, 067 za 163Q + redko). Primerljiva primerjava Man-Whitney-jevega U- testa je pokazala bistveno razliko le med „ni redke variante“ in „163Q + redko“ pri genotipu 163R / Q (slika 3).

V analizi z več regresijo z r , skupnim številom alelov 92M in 163Q smo dobili naslednji najboljši model

Image

kjer je bil 650NM odstotek odbojnosti pri valovni dolžini 650 nm, je bil SEX kodiran kot 0 za ženske in 1 za moške ( P- vrednosti za t- test za vsako spremenljivko v modelu: 7.28E – 09, 1.29E – 07, 3.76E –03 in 3, 74E – 02). Analiza linearne regresije z r kot edino neodvisno spremenljivko je pokazala regresijski koeficient 0, 65 ( P = 1, 18E – 02, 95% CI = 0, 15–1, 15).

Noben od kovariatov ni pokazal pomembne korelacije s pege. Χ2- test je pokazal, da so se pege pojavile neodvisno od SEX ( χ 2 = 1, 45, df = 1, P = 0, 228) in indeksa Ryukyu (samo 0 in 4, χ 2 = 3, 41, df = 1, P = 0, 065). T- test je pokazal enako starost in indeks telesne mase v obeh skupinah pege, "prisotnih" in "odsotnih". OR-ji za pesek za manjše alele glede na vzorce konsenzusnih alelov so prikazani v tabeli 3. Samo V92M je pokazal pomembno spremembo kvote za pege; posamezniki z alelom 92M so imeli OR 3, 11 glede na posameznike, ki so 92V homozigoti (95% IZ = 1, 18–8, 17). Podobno je v modelu logistične regresije samo V92M pokazal pomemben koeficient ( P = 0, 030)

Tabela polne velikosti

Image

brez R163Q in 942A> G, niti RARE ne prispeva bistveno, ko je dodan. OR za pesek alela 92M smo dobili kot eksponentno vrednost regresijskega koeficienta (1, 00), ki je znašala 2, 72 (95% CI = 1, 10–6, 71). V modelu logistične regresije z r kot opisno spremenljivko je regresijski koeficient za r znašal 0, 95 ( P = 0, 100), kar je enako 2, 58 (95% CI = 0, 83–7, 96) in ni pomembno.

Diskusija

Govori se, da ima Ryukyuan temno kožo v primerjavi z Japonci iz Main Islanda. V antropološki raziskavi o ljudeh Okinawana je Suda 58 ugotovil, da imajo ljudje z otoka Okinawa temnejšo kožo na čelu kot ljudje iz Kagošime (slika 1), ko so jo ocenili z barvno paleto Broca. Po drugi strani pa Torii 59 ni našel nobene razlike v barvi kože na notranji nadlakti, kot jo določa barvna paleta Broca med 77 študentkami iz Okinawe in 30 z glavnih japonskih otokov, ki so vse prebivale na otoku Okinawa. Razlog, ki ga je navedel za podobnost v barvi kože, je bil ta, da je bila njihova koža zaščitena pred sončno svetlobo, prekrita z oblačili z rokavi, kar je bil tedaj privilegij ljudi srednjega in višjega razreda. Prav tako naša raziskava ni našla statistično pomembne razlike v lahkotnosti kože na notranji nadlahti med ljudmi porekla Ryukyuan in ljudmi japonskega porekla Main Island, ki živijo v istem okolju, na otoku Okinawa. Skupaj te študije kažejo, da očitna razlika v tonusu kože med japonskim Okinavanom in glavnim otokom morda ni prirojena, vendar je bolj verjetno zaradi razlike v ravni UV sevanja med Okinavo in glavnimi Japonskimi otoki. To ugotovitev potrjujejo podatki Japonske meteorološke agencije, da je Naha na otoku Okinawa skozi vse leto izpostavljena višji stopnji UV sevanja kot Kagoshima na otoku Kyushu, enem glavnih otokov; Povprečni dnevni kumulativni standardni odmerek eritem (DCSED) med letoma 1994 in 2008 je bil 2, 84 kJ m −2 v Nahi, povprečni DCSED med letoma 1997 in 2004 pa 2, 41 kJ m −2 v Kagošimi.

V naših podatkih je bilo očitno opaziti spolni dimorfizem pri odbojnosti kože; srednja vrednost za ženske je bila višja kot pri moških. Ta vzorec je bil skladen z vzorcem, ki je bil pogosto naveden v prejšnjih raziskavah. 4, 17, 60 Da so pri ženskah manjše odstopanje L * kot pri moških, bi to pokazalo tudi uporabo sončne kreme ali izogibanje izpostavljenosti UV ženskam. Ta ugotovitev lahko odraža trend med japonskimi ženskami, ki živijo na Okinavi, da si želijo lahkega tona kože, kot je zapisano v drugih mestih v vzhodni Aziji. 61 We found no significant association between skin reflectance and age, which may be explained by the majority of the participants being in early adulthood.

As a result of the regression analysis with the month variables, we found that JUN and JUL were associated with a lighter skin tone. This could be explained by a time lag between the UV exposure and tanning response, and between tanning and depigmentation. According to the data of the Japan Meteorological Agency, a monthly average of DCSED in Naha is the highest in July (Supplementary Figure S1). It is possible melanin accumulates in the skin of inner upper arms towards the end of high UV months and the skin remains pigmented until it slowly loses a tan.

Association analysis between MC1R variants and skin reflectance showed that the 163Q allele had the effect of increasing the lightness of skin at the inner upper arm in an additive or recessive mode. Duffy et al. 42 suggested an additive mode for the effect of r on skin reflectance of Europeans at wavelength 650 nm, and the regression coefficient for r (0.9 with 95% CI=0.2–1.6) was similar to that found in the present study (0.7 with 95% CI=0.20–1.20). In the multiple regression model with only MC1R variants, R163Q and RARE, the adjusted R 2 was 0.012, indicating that the model explained 1.2% of the total variability in L* of inner upper arm for L* values that were standardized by sex. This finding is consistent with our expectation that each variant contributes a small amount to a quantitative trait such as skin pigmentation. Examination of the contribution of genes other than MC1R to skin pigmentation in Asian populations is awaited.

We also found a significant association between V92M and freckling in a logistic regression (OR=2.72, 95% CI=1.10–6.71); this finding was consistent with findings from a study by Motokawa et al. 39 (OR=3.08, 95% CI=1.35−6.56). However, the association between freckling and R163Q was not significant in our study (OR=1.12, 95% CI=0.54–2.4); this finding was not consistent with their results (OR=2.08, 95% CI=1.01–4.12). In addition, when V92M and R163Q were combined as r , our logistic regression analysis did not show a significant effect of r on freckling although Motokawa et al. 39 and Duffy et al. 42 found it significant. Further examination is required to conclusively determine the effect of R163Q on freckling.

The haplotype network we constructed had a star-like composition of haplotypes surrounding the R163Q variant. 62 The negative value (−1.66) obtained for Tajima's D , showing an excess of observed rare variants relative to the expectation, indicated a possibility of recent demographic expansion or positive selection. Voight et al. 63 obtained an average Tajima's D of 0.18 for Han Chinese ( n =15) based on the resequencing data of 50 unlinked autosomal noncoding regions. Their result suggests that demographic history in East Asia has shifted the D from 0 toward the positive direction, which is the opposite direction of our D ; therefore, the value we obtained for MC1R cannot be explained by demography. In addition, the star-like composition was observed only at R163Q; therefore, this pattern may support that the frequency of 163Q alleles has increased recently. Thus, our result indicated the involvement of selection on the 163Q allele; this conclusion is consistent with a finding from a study by Coop et al. , 38 which showed a selective sweep on the same allele. The present study showed an association between the 163Q allele and light skin tone in East Asia; this association indicated positive selection on light-toned skin among East Asians.

Although our findings indicated that positive selection on MC1R had occurred, it is difficult to identify the force of selection. When considering sexual selection on the light-toned skin, whether the change in skin reflectance is discernible or not is important. The amount of change in L* predicted by our multiple regression model is 0.82 (2 × ZL* × 2.47) for females and 1.08 (2 × ZL* × 3.30) for males, comparing 163Q homozygotes (163Q/Q) to 163R homozygotes (163R/R). A similar amount of change is predicted for the nonsynonymous rare variants (0.97 for females and 1.30 for males). These differences are distinguishable by the eye if the two shades are placed close to each other, according to the definition adopted by CIELAB, the color space we used. 64 Psychological studies on perception of skin color would help in understanding the relationship between the statistically significant change in L* of skin and discernible change in lightness.

Population structures in the Japanese archipelago have been observed, especially between Ryukyuan and Main Island Japanese. 65 As we found no significant difference in neither skin reflectance nor freckling between Ryukyuans (Ryukyu Index=4) and Main Island Japanese (Ryukyu Index=0), genetic factors that strongly affect pigmentation are unlikely to be highly differentiated between these subpopulations. To further investigate the effects of population stratification on our association study, we examined other SNPs (rs3827760, rs853975, rs350886, rs1048610), which are differentiated among populations across the world in a similar manner to MC1R R163Q (Supplementary Figures S2–S6), and found no association of these SNPs with pigmentary traits (Supplementary Table S4). Therefore, population stratification, if any, had only a small effect on our association study.

Our results suggested that two major nonsynonymous variants, V92M (rs2228479) and R163Q (rs885479), had different influence on skin phenotype; V92M was associated with freckling, whereas R163Q was associated with the lightness of skin. These two variants are located in different domains of the protein MC1R; V92M is in the second of seven transmembrane domains, whereas R163Q is in a cytoplasmic loop. SIFT, a software to predict the effect of amino acid substitutions on protein function based on the conservativeness of amino acid in the closely related sequences, predicted that V92M and R163Q would not damage the function of MC1R with scores of 0.68 and 0.21, respectively. 66 According to PolyPhen-2, another tool that predicts impact of amino acid substitutions on the structure of proteins and the subsequent functional change, both of the 163Q and 92M mutations were predicted to be benign with scores of 0.015 and 0.004, respectively, whereas the rare variants were predicted to be 'possibly damaging' or 'probably damaging' (scores ranged from 0.656 to 0.999), except for V140M (score=0.390; Supplementary Table S5). 67 This is consistent with the finding that the effect of RARE on skin reflectance was twice as much as R163Q in our multiple regression analyses. However, an in vitro study showed that the 92M allele caused impaired MC1R function; in contrast, the 163Q allele had almost the same response to α-melanocyte simulation hormone as the human consensus allele. 32 These results may explain the difference in the effect of the V92M and R163Q alleles on skin pigmentation.

As discussed above, the 163Q allele does not cause any change in the MC1R ligand-binding amino acid sequence; hence, the allele may retain a normal ability to promote eumelanin (dark pigment) synthesis through activation of adenylate cyclase and the subsequent accumulation of cyclic adenosine monophosphate in a melanocyte cell. An in vitro study on the function of MC1R variants also indicates that 163Q functions normally when compared with the consensus. 32 Motokawa et al. 68 investigated polymorphisms in the promoter region of MC1R linked to R163Q among 247 Japanese. They found that the promoter haplotypes with a combination of −490T, −445A and −226T, 98.5% of which bore the 163Q allele in the coding region, showed lower OR for initiating freckles and solar lentigines than did the human consensus haplotype (−490C, −445G, −226A). They suggested that the −490C>T variant might be responsible for the decreased promoter activity, based on the finding by Moro et al. 69 that a deletion from −517 to −447 damages the promoter activity. Therefore, impaired function in the promoter region, caused by the variant(s) in linkage disequilibrium with R163Q, may explain the association between the 163Q allele and the lightness of skin, which we found in this study. Further functional studies are needed to reveal the mechanism.

In summary, we found that the 163Q allele contributed to the lightness of skin in Japanese people. The effect of 92M in increasing the odds of freckling was also confirmed. These results explain a part of the difference in constitutive skin pigmentation between Asian and non-Asian populations, as well as the north-to-south gradient in pigmentation across Asia. Association studies on admixed populations or comparative studies in allele frequencies among different populations are required to further elucidate the evolution of skin pigmentation among the people of Asia.

Dodatne informacije

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatne informacije

    Dodatne informacije spremljajo prispevek na spletni strani Journal of Human Genetics (//www.nature.com/jhg)